江苏省沿海地区水产养殖主要致病菌耐药性研究

摘要

江苏省沿海地区海、淡水资源丰富，养殖池塘众多，滩涂广阔，是我国重要的水产养殖基地。近些年，细菌性疾病在江苏省沿海地区水产养殖中普遍发生，给水产养殖业造成巨大的损失。为了预防和控制细菌性疾病，水产养殖从业人员经常使用各种抗菌药物，一定程度地对控制疾病起到了较好的作用。但由于在养殖生产上药物的使用缺乏科学性，部分抗菌药物在水产养殖上使用后出现了耐药现象，一方面影响了产业的可持续发展，另一方面也威胁着水产品的质量安全和水生态环境。
　　为了解江苏省沿海地区水产养殖致病菌的耐药性状况，本研究以江苏省沿海地区发病和健康水生动物为对象分离获得了377株细菌，经形态学、生理生化和16S rRNA序列比对的方法鉴定，其中曾报道为水产养殖致病性细菌的有274株。来源分布为：连云港地区46株，盐城地区89株，南通地区116株；海水菌64株，淡水菌210株；鱼类菌150株，甲壳类菌99株。其中常见水产养殖主要致病菌187株，包括气单胞菌90株，弧菌54株，假交替单胞菌22株，美人鱼发光杆菌7株和不动杆菌14株。
　　利用K-B纸片扩散和微量肉汤稀释法对江苏省沿海地区分离的水产养殖致病菌进行抗菌药物敏感性监测。纸片扩散试验结果发现江苏省沿海地区的水产养殖主要致病菌对磺胺异噁唑、青霉素、强力霉素和四环素表现较强耐药性，耐药率分别为66.06％、64.23%、32.12%和30.66%；对环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、新霉素、头孢曲松、红霉素、诺氟沙星和氟苯尼考耐药率较低，依次为5.84%、3.65%、6.57%、5.11%、6.57%、8.03%、9.49%。肉汤稀释法结果表明79.07%水产养殖致病菌对阿莫西林的MIC达到甚至超过32μg/mL，96.12%的菌株对硫酸二甲嘧啶的MIC达到甚至超过128μg/mL，表现出较高耐药性。江苏省沿海地区分离的部分水产养殖致病菌出现多重耐药，二重、三重、四重、五重耐药率分别为22.3%、13.5%、10.9%、6.6%，甚至出现十一重耐药的菌株。江苏省沿海地区水产养殖致病菌耐药性整体上表现出由南向北逐渐增强，淡水源菌株高于海水源菌株，鱼源菌株比甲壳类菌株严重的规律。
　　通过PCR方法对江苏省沿海地区90株水产源气单胞菌耐药基因进行扩增，研究了各耐药基因的检出率，统计了该地区不同种类药物的耐药基因型，初步分析了不同基因型与耐药表型间的关系。结果发现，江苏省沿海地区90株水产源气单胞菌β-内酰胺耐药基因TEM、IMP、AmpC、OXA-23、OXA-24检出率分别为0、6.67%、41.11%、4.44%和24.44%，共出现8种耐药基因型，其中携带IMP基因型的菌株75%对青霉素耐药，携带AmpC和OXA-24基因型的菌株92.86%表现耐药，其他基因型菌株100%表现耐药。另有部分菌株未检测到β-内酰胺耐药基因，但对青霉素表现较强耐药，说明在该地区水产致病菌中介导青霉素耐药的还存在其他基因。氨基糖苷类耐药基因aph(3')-Ia、aac(6')-Ib、ant(3'')-Ia和ant(3'')-Ia检出率分别为28.89%、67.78%、32.22%和8.89%，共有11个氨基糖苷类耐药基因型。试验菌株对新霉素敏感性较高，分析介导氨基糖苷类耐药机制可能是多个基因共同作用的结果。磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3携带率分别为34.44%、28.89%和45.56%，主要有sul1、sul2、sul3、sul1/sul2、sul1/sul3、sul2/sul3、sul1/sul2/sul3七种基因型，相应基因型菌株对磺胺异噁唑耐药率分别为90%、60%、48%、90%、77.78%、75%和100%。四环素类耐药基因tetA、tetC和tetM检出率分别为32.22%、34.44%和60%，共有tetA、tetC、tetM、tetA/tetC、tetA/tetM、tetC/tetM和tetA/tetC/tetM七种基因型，分别有75%、33.33%、22.73%、0%、66.67%、33.33%和36.36%的菌株表现对强力霉素耐药，75%、33.33%、27.27%、100%、41.67%、33.33%和27.27%的菌株表现对四环素耐药。tetA和tetM基因的携带率与耐药表型无明显相关性，四环素类不同药物品种的主要耐药基因型存在一定差异。氟苯尼考耐药基因floR检出率为76.67%，但携带floR基因的菌株并没有表现出较明显的耐药性，推测floR基因介导氟苯尼考较低水平耐药。喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrB-24、qnrS和qepA检出率分别为3.33%、52.22%、46.67%、26.67%和53.33%，共出现14个喹诺酮类耐药基因型，但未发现耐药表型与耐药基因型间存在较密切的关系，分析认为介导喹诺酮类药物耐药可能还与其他基因有关。
　　综上所述，江苏省沿海地区水产养殖中条件致病菌较多且分布广泛，其对抗菌药物产生不同程度的耐药性，特别是对青霉素、磺胺异噁唑、强力霉素和四环素等耐药较为严重，耐药性在淡水鱼类品种上表现尤为突出。建议该地区在防治水产细菌性病害过程中做到科学用药，防止药物的耐药性进一步增强。江苏省沿海地区水产养殖气单胞菌耐药基因和基因型多样性程度高，其与耐药表型的关系复杂，推测介导江苏省沿海地区水产养殖主要致病菌耐药是一个多因子共同作用的结果。

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第一章 引 言

1.1 渔用抗菌药物简介

1.2 我国渔用抗菌药物耐药性现状

1.3 渔用抗菌药物耐药性研究方法

1.4 抗菌药物耐药机制

1.5 我国渔用抗菌药物耐药基因研究进展

1.6 研究的目的和意义

第二章 江苏省沿海地区水产养殖主要致病菌分离鉴定

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论分析

2.4 小结

第三章 江苏省沿海地区水产养殖主要致病菌药物敏感性分析

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论分析

3.4 小结

第四章 江苏省沿海地区水产源气单胞菌耐药基因分析

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论分析

4.4 小结

参考文献

致谢

研究成果