海蜇毒素磷脂酶A2和穿孔蛋白基因的克隆与表达

摘要

海蜇（Rhopilema esculentum）隶属于刺胞动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属，作为一种大型的可食用经济水母，在我国海洋渔业中占有重要地位。其基础生物学研究深入，人工繁育、增养殖技术成熟，是研究水母发育过程基因表达调控及水母毒素组成、结构和功能的理想模式生物。
　　本研究在454转录组测序的基础上，通过EST序列分析、cDNA末端快速扩增（RAC E）技术从刺胞动物门的海蜇中克隆获得两个磷脂酶 A2基因cDNA全长序列（命名为RePLA2-1、RePLA2-2）、两个穿孔蛋白基因cDNA全长序列（命名为 RePFP-1、RePFP-2），并对这些基因进行了原核表达及重组蛋白功能分析。详细结果信息如下：
　　1、RePLA2-1基因cDNA全长为824bp，开放阅读框（ORF）504bp，能够编码167个氨基酸。预测RePLA2-1的分子式为C833H1283N235O241S15，推测的半衰期为30h，不稳定指数为61.93，属于不稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.124，推测该蛋白为水溶性蛋白。根据氨基酸序列预测的分子量和等电点分别是18.93KDa和8.02。RePLA2-2基因cDNA序列全长840bp，预测的开放阅读框（ORF）包含495个核苷酸，编码165个氨基酸序列。N-端前23个核苷酸为信号肽，5’非编码区(UTR)和3’非编码区 UTR分别包含6个核苷酸和336核苷酸。预测RePLA2-2的分子式为C844H1278N228O232S13，分子量和等电点分别是18.747KDa和8.94。推测的半衰期为30 h，不稳定指数为32.64，属于稳定蛋白。亲水性平均数（GRAVY)为-0.276，推测该蛋白为水溶性蛋白。利用overlap PCR技术，获得了RePLA2-1、RePLA2-2基因组全长序列。RePLA2-1基因组序列全长2937bp，由4个外显子和3个内含子。ReP LA2-2基因组序列全长2113bp，由2个外显子和1个内含子组成。Blast比对结果显示，RePLA2-1、RePLA2-2属于Phospholip_A2_3家族。系统进化分析表明，RePLA2-1、RePLA2-2与僧袍芋螺、星状海葵、长牡蛎毒素PLA2聚为GIX PLA2一支，与GXIII、GXII PLA2家族成员共聚为pfam-collection。荧光定量PCR显示，蜇RePLA2-1、RePLA2-2基因在海蜇不同发育阶段均有表达。其中，RePLA2-1在海蜇水螅体发育阶段及横裂体发育阶段具有较高表达量。在横裂体发育阶段RePLA2-1 mRNA达到四个发育阶段的最高值，为碟状体阶段的12.2倍；其次为水螅体体阶段，为水碟状体阶段的7.6倍；水母体阶段也达到了碟状体阶段的5.5倍。RePLA2-2在海蜇水母体、碟状体发育阶段具有较高表达，分别为横裂体阶段的10.8倍和4.4倍。在水螅体阶段表达量为横裂体阶段表达量的1.3倍，无明显差异。以海蜇cDNA为模板，设计特异性引物扩增RePLA2成熟肽部分，进行原核表达。重组蛋白以包涵体的形式表达，经纯化、透析复性后获得的重组蛋白能够水解大豆卵磷脂。
　　2、获得的海蜇RePFP-1 cDNA全长2303bp，包含1883bp的开放阅读框，能够编码610个氨基酸，3’UTR包括一个多腺苷酸Poly(A)尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。RePFP-1基因组全长5786bp，由7个外显子6个内含子组成，所有内含子外显子的剪切位点均符合 GT-AG剪切规则。RePFP-2 cDNA全长2212bp，包含1842bp的开放阅读框，编码613个氨基酸，3’UTR包括一个多腺苷酸Poly(A)尾和一个多腺苷酸化加尾信号AATAAA。RePFP-2基因组全长8609 bp，由8个外显子7个内含子组成，所有内含子外显子的剪切位点均符合 GT-AG剪切规则。RePFP-1和RePFP-2之间氨基酸序列相似率为65％，都含有N端MACPF结构域，与其他穿孔蛋白不同的是RePFP-1和RePFP-2蛋白C端均含有一个卵黄膜外层蛋白I结构域（VMO I）。将RePFP-1和RePFP-2与穿孔素、补体等含MACPF结构域穿孔蛋白家族成员氨基酸序列进行进化分析，结果表明RePFP-1和RePFP-2氨基酸序列与原生生物聚为一簇。利用实时荧光定量PCR技术，我们对RePFP-1和RePFP-2 mRN A在海蜇水螅体、横裂体、碟状体和幼水母体四个典型发育阶段进行了相对表达量检测，结果表明，尽管RePFP-1和RePFP-2在海蜇四个发育阶段都具有表达，但在早期发育水螅体阶段有明显的表达上调，而在幼水母体阶段表达量较低。因此，结合 VMOI在其他生物卵子发生过程中的作用我们推测RePFP-1和RePFP-2蛋白可能并不仅是作为毒素起作用，还可能参与海蜇早期发育的调控。在RePFP-1和RePFP-2 MACPF结构域两端分别设计引物，以海蜇cDNA为模板扩增海蜇 PFP蛋白 MACPF结构域部分，并构建原核表达重组质粒pet28-RePFP-1和pet28-RePFP-2，将重组质粒转化到表达菌株 BL21(DE3)感受态细胞，并实现了重组表达。但是，重组表达的蛋白经纯化、透析复性后并无抑菌活性。

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引言

第一章 水母磷脂酶A2（ PLA2）毒素和穿孔蛋白研究进展

1. 磷脂酶毒素A2（PLA2）研究概况

1.1 PLA2的分类、生物功能及其理化性质

1.2 PLA2的分子结构

1.3 PLA2的生理活性

2. 穿孔蛋白研究进展

2.1胆固醇依赖的细胞溶素（CDCs）

2.2 攻膜复合体/穿孔素超家族(MACPF)

2.3 MACPF/CDCs蛋白的生物功能

3. 本研究的意义及目的

3.1 研究意义

3.2 研究目的

4. 采用的技术路线

第二章 海蜇水母毒素PLA2基因的克隆与表达

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2 结果

2.1海蜇磷脂酶A2基因全长cDNA的克隆与序列分析

2.2海蜇磷脂酶A2基因系统进化

2.3海蜇磷脂酶A2基因组结构分析

2.4 海蜇磷脂酶A2不同发育阶段表达

2.5 海蜇磷脂酶A2重组表达及活性分析

3 讨论

第三章 海蜇穿孔蛋白基因的克隆与表达

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2. 结果

2.1 RePFP cDNA序列全长及推断的氨基酸特征

2.4 RePFP蛋白质结构域分析

2.3 RePFP的系统进化分析

2.4 RePFP的基因组结构分析

2.5 海蜇不同发育阶段RePFP基因的表达

2.6 RePFP的原核表达

3.讨论

3.1 MACPF超家族蛋白生物功能的多样性

3.2 PFP蛋白C端多样性

第四章 论文总结

参考文献

缩略语表

在学期间参与科研情况

致谢