小麦中隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇真菌毒素产生规律及分离纯化技术研究

摘要

小麦是中国半数以上人口的主要食物来源。小麦及其制品的安全性直接关系到人民的生命安全。小麦、大麦等禾谷类农作物生长及储存过程中容易受到镰刀菌属真菌的侵染，产生有毒的次级代谢产物。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，呕吐毒素）是其中最常见的真菌毒素，它是食品中最危险自然发生而污染的真菌毒素之一。然而，研究的进一步深入发现被禾谷镰刀菌侵染后的谷物不仅存在游离态的DON，还有一些隐蔽型的DON，如乙酰化DON（3ADON、15ADON）及DON-β-D-葡萄糖苷（D3G）。这些毒素在常规的提取过程中易被漏检，当毒素进入人和动物体内后会释放出DO N毒素，成为潜在的食品安全威胁毒素。但由于现在对隐蔽型DON的产生规律及毒理性研究还处于初级阶段，并且D3G毒素的分离纯化方式主要通过化学合成得到的，需要标准品作为合成原料，价格较为昂贵且步骤比较复杂。因此，本研究对DON、D3G、3ADON、15ADON毒素的产生规律进行探究，并为D3G毒素的分离纯化提供一种新的方式，为后续研究提供充足原料。
　　本研究首先通过将三株不同禾谷镰刀菌接种不同状态的小麦籽粒（高温高压灭菌、8kGy辐照、15kGy辐照）进行培养，摸清隐蔽型 DON的产生条件，确定何种状态的小麦籽粒能产生隐蔽型DO N；其次通过室内接种实验及室外大田实验探究隐蔽型DO N的产生是否与小麦品种、不同禾谷镰刀菌菌株等因素的关系，探明不同小麦品种，不同菌株与隐蔽型DON的关系；最后通过优化禾谷镰刀菌PH-1的产毒条件，确定何种条件下D3G毒素的累积量最高。并通过优化提取条件进行，确定快速、大量提取D3 G毒素的方法。本研究为后续D3G产生机理研究提供理论依据，为后续毒理学研究提供简便低廉快捷制备标准品的方法。本研究主要内容和研究结果如下：
　　1.本研究为了确定麦粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其隐蔽型的产生与镰刀菌菌株、小麦籽粒存活状态及培养天数的关系，将禾谷镰刀菌菌株PH-1、F-1和5035分别人工接种至经高温灭菌、8kGy和15kGy辐照的麦粒中25℃培养7、14、21、28、35d后，通过LC-MS/MS方法测定隐蔽型DON毒素在麦粒中的含量。不同处理的麦粒中DON含量均随培养时间延长逐渐增加；PH-1接种麦粒培养35d时DON含量最高为624490.25μg/kg。禾谷镰刀菌接种灭菌麦粒及15kGy辐照麦粒均未检出D3G毒素；接种8kGy辐照小麦籽粒培养后均可检出D3G毒素，D3G含量随着培养天数延长逐渐降低，F-1接种8kGy辐照麦粒的D3G含量显著（p<0.05）高于PH-1及5035。F-1接种麦粒培养7d时D3G含量最高为15923.43μg/k g。高压灭菌小麦由于胚芽被破坏不能发芽，而高剂量15kGy辐照小麦也不能够发芽，而8kGy辐照小麦仍保留了75％-80%的发芽率，却能够较好地去除小麦中存在的背景菌。通过本章实验我们确定只有禾谷镰刀菌接种能够发芽的麦粒才能产生D3G，而乙酰化DON的产生不受这一因素制约，这一结论为后续的研究提供依据。
　　2.通过以上研究表明只有8kGy能够发芽的小麦才能够产生 D3G。为了探究不同小麦抗性品种间产生隐蔽型DO N是否存在差异，本部分实验分为花期前室内胚芽鞘接种与室外大田接种两部分，探究小麦发育不同时期毒素累积情况。将三株不同禾谷镰刀菌接种对镰刀菌具有不同抗性的扬麦15号、扬麦16号、宁麦13号、苏麦3号（抗性由低到高排列），研究麦粒中毒素累积情况。实验结果显示，室内胚芽鞘实验表明扬麦15号DON毒素含量显著性（p<0.05）高于苏麦3号，而扬麦15号D3G毒素含量显著性（p<0.05）低于苏麦3号；大田接种实验中，扬麦15号的病小穗率最高；D3G/总DON与病小穗率具有相关性，PH-1接种小麦相关性最高 R2=0.91；通过本章的实验推测感染禾谷镰刀菌的小麦 D3 G的累积情况与小麦的抗性有一定关系。
　　3. D3G是脱氧雪腐镰刀菌烯醇的一种结合态衍生物，可以逃脱常规的检测。然而，少量毒理学研究表明D3G经过哺乳动物的胃肠消化道后会释放出其有毒前体物质。为了食品安全检测及毒理学实验提供纯化后的D3G，我们尝试了一种经济和能够重复的纯化方法。首先，通过将禾谷镰刀菌菌株PH-1接种后，在不同温度和水分活度下培养，确定温度为25℃、Aw=0.99时，D3 G毒素累积量最高。其次，将接种后小麦粉碎后加入乙腈/水/乙酸提取（79/20/1，v/v/v）经旋转蒸发蒸干。剩余的液体用乙酸乙酯提取，将水层收集后，真空冷冻干燥，经后续纯化过程得到 D3 G毒素。通过比较几种不同提取溶剂，乙腈/水/乙酸提取效果最好，得到最终产品的相对回收率为85%。本实验利用接种辐照小麦提取 D3G，为标准品的分离纯化提供了新的方法。
　　上述研究结果为隐蔽型DO N毒素的产生机制、小麦抗性机制研究奠定了基础。并且为获得D3G标准品提供了一种新的分离纯化方法，为进一步探究D3G毒素毒理学研究提供原料。

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引言

第一章 文献综述

1.小麦赤霉病

2.镰刀菌及镰刀菌毒素

3脱氧雪腐镰刀菌烯醇的性质

4隐蔽型真菌毒素概述

第二章 三株禾谷镰刀菌接种不同基质产生隐蔽型DON的累积分析

2 .1 材料与仪器

2 .2试验方法

2 .3 结果与讨论

2 .4结论

第三章 胚芽鞘及田间接种小麦中毒素产生规律研究

3 .1 材料与器材

3 .2实验方法

3 .3结果与讨论

3 .4结论

第四章 隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分离纯化技术初步研究

4 .1 材料与设备

4 .2 实验方法

4 .3 结果与讨论

4 .4 本章小结

全文总结

参考文献

不足与展望

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢