基于多基因位点的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类遗传多样性与种群遗传结构分析

摘要

本研究采集了17个地理种群163尾个体的沙塘鳢属（Odontobutis）鱼类，依次为中华沙塘鳢5个种群：宜都种群（YiDou population，简称“YD”）8尾、宜昌当阳种群（DangYang population，简称“DY”）10尾、荆州种群（JingZhou population，简称“JZ”）10尾、岳阳洪湖种群（HongHu population，简称“HH”）6尾和鹰潭种群（Yingtan population，简称“YT”）10尾；河川沙塘鳢12个种群分别为：六安种群（LuAn population，简称“LA”）10尾、巢湖种群（ChaoHu population，简称“CH”）10尾、宣城种群（XuanCheng population，简称“XC”）10尾、黄山种群（HuangShang population，简称“HS”）9尾、淮安种群（HuaiAn population，简称“HA”）10尾、扬州种群（YangZhou population，简称“YZ”）10尾、高邮种群（GaoYou population，简称“GY”）10尾、靖江种群（JingJiang population，简称“JJ”）10尾、湖州九里桥种群（HuZhou Jiuliqiao population，简称“HZJ”）10尾、湖州太湖种群（HuZhou Taihu population，简称“HZT”）10尾、苏州种群（SuZhou population，简称“SZ”）10尾和上海种群（ShangHai population，简称“SH”）10尾。通过线粒体分子标记（线粒体全长与D-loop区）和核基因标记（3个EPICs标记与微卫星标记）的扩增，分析了我国长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类的种群遗传多样性与遗传结构，并探讨了这种遗传多样性差异性分布的空间格局成因以及与地理环境之间的关系。
　　主要结果如下:
　　1.长江流域沙塘鳢属鱼类线粒体基因组重排与分子标记筛选
　　采用引物步移法PCR扩增，获得全长为16846bp的河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)线粒体全基因组（mtDNA），并对其基因结构、重排机制及在系统发育中的应用进行了分析。主要结果为：
　　(1)河川沙塘鳢mtDNA由37个基因和一个非编码控制区组成；除ND6和8个tRNAs外，其他基因都编码在重链(H)上；tRNA基因因发生滑移重排(shuffling)，将经典的线粒体基因组HSL(tRNAHis-tRNAser-tRNALeu)排序变成了SLH(tRNAser-tRNALeu-tRNAHis)排列，造成在tRNALeu与tRNAHis、ND4与tRNASer之间分别插入了320bp和42bp的两个“匿名区”。
　　（2）检测的112种鲈形目(Perciformes)鱼类中，仅有13种(11.61％)发生了mtDNA基因重排现象，而沙塘鳢属的中华沙塘鳢(O. sinensis)、平头沙塘鳢(O. platycephala)与河川沙塘鳢的基因重排位置一致，揭示其可能是沙塘鳢属鱼类进化过程中的一个重要分子“标签”。
　　（3）ND4和ND5为两个可用于虾虎鱼亚目(Gobioidei)鱼类科阶元水平的系统发育关系重建的合适分子标记。
　　2.基于线粒体控制区的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类种群遗传多样性与种群遗传结构分析
　　从YD、DY、JZ、HH和YT等5个中华沙塘鳢种群，采集44尾个体；从LA、CH、XC、HS、HA、YZ、GY、JJ、HZJ、HZT、SZ和SH等12个河川沙塘鳢种群，采集119尾个体，扩增线粒体控制区（D-loop）1041bp，分析时去除两端测序错误和比对缺失区（missing data）后，选取906bp序列用于遗传学分析，结果如下：
　　(1)遗传多样性分析。中华沙塘鳢有73个变异或多态位点（8.06%），44条碱基序列可定义22个单倍型，其中H6为共享单倍型（34.09%）；河川沙塘鳢有21个变异或多态位点（2.32%），119条碱基序列可定义12个单倍型，共享单倍型为H11（63.86%）、H16（3.36%）与H18（10.08%），河川沙塘鳢单倍型较为贫乏。
　　(2)种群遗传多样性分析。中华沙塘鳢种群的平均单倍型多样性（Hd）与核苷酸多样性（π）依次为0.7197和0.0057；而河川沙塘鳢的为0.1796和0.0007。其中YT、DY与CH等种群的Hd和π较高，其他种群的较低，尤其是HS与LA等种群的最低。以上结果显示出，依赖于线粒体控制区，长江流域及淮河流域分布的沙塘鳢属鱼类遗传多样性较低，且中华沙塘鳢的遗传多样性较河川沙塘鳢的高。
　　(3)遗传分化与种群遗传结构分析。中华沙塘鳢与河川沙塘鳢的种群间遗传分化指数（FST）依次为0.4822与0.9023，处于较高水平遗传差异（FST>0.25）；AMOVA分析结果显示两物种具有显著的遗传结构；种群间NJ分子系统发育关系揭示：17个沙塘鳢种群显著的分为两大支，即中华沙塘鳢的5个种群（YT、YD、HH、DY、JZ）22个单倍型聚为一支（Cluster1），河川沙塘鳢的12个种群12个单倍型序列聚为另一大支，而且也可以看出河川沙塘鳢12个种群可以细分为两个大的聚类支，分别为分布于长江中游的LA、CH、XC和HS4种群聚为一支（Cluster3），分布于长江下游及淮河下游的8个种群4个单倍型序列聚为一支（Cluster2），且3个聚类分支呈现出按不同地理区域分别聚类的现象，单倍型最小跨度网络关系图结果与其一致。
　　(4)种群历史动态。中性检测和错配分析均揭示，中华沙塘鳢种群都曾发生过种群扩张事件；河川沙塘鳢种群除GY、SZ、HZT和CH等4种群外都没有发生过种群扩张事件。按聚类关系来看，Cluster1与Cluster2聚类群经历了历史种群扩张事件，Cluster3未发生过种群扩张事件。若以线粒体D-loop基因每百万年3%～12%的进化速率，估计得到的中华沙塘鳢与河川沙塘鳢种群扩张时间分别为0.0237~0.0946Myr与0.0048~0.0193Myr前，均约为第四纪更新世晚期。中华沙塘鳢的分化时间较早。
　　3.基于核基因EPICs分子标记的沙塘鳢属鱼类的种群遗传多样性及分子生物地理学研究EPICs(Exon-primed intron-crossing markers)，是一种匿名核基因标记的研究，原理是在匿名外显子区设计引物对中间内含子进行扩增，使得该标记既具有外显子的保守特性，又具有内含子进化速率快的特点。EPICs内含子标记因外显子较内含子更保守并且有大量匿名基因，已成功的运用于物种水平和更广泛的生物分类单元研究中。
　　本实验克隆选取55378E1、55305E1和36298E1全序列，分别长1300bp、1600bp与2100bp，分析时去除两端测序错误和比对缺失区（missing data），并进行显著性PHI检测去除重组序列52bp，然后拼接为3733bp进一步对上述17个沙塘鳢属鱼类种群进行遗传结构分析，结果如下：
　　（1）序列分析。中华沙塘鳢种群有279个多态位点（7.47%），44条碱基序列可定义44个单倍型（haplotypes）；河川沙塘鳢有343个多态位点（9.19%），119条碱基序列可定义115个单倍型。
　　（2）遗传多样性分析。中华沙塘鳢种群的单倍型多样性（Hd）与核苷酸多样性（π）为1.0000和0.0118，核苷酸多样性变化范围为0.0034~0.0121；而河川沙塘鳢的Hd与π为0.9994和0.0039，Hd与π变化范围在0.9167~1.0000和0.0007~0.0037之间。显示出不论是中华沙塘鳢还是河川沙塘鳢，都是单倍型多样性高、核苷酸多样性低，且中华沙塘鳢遗传多样性高于河川沙塘鳢的遗传多样性。
　　（3）种群NJ聚类分析。中华沙塘鳢5个种群间遗传距离变化范围为0.0086~0.0149；河川沙塘鳢12个种群间的遗传距离变化范围为0.0026~0.0067。NJ单倍型种群遗传距离分子系统发育关系显示：17个沙塘鳢种群显著的分为两大支，即中华沙塘鳢的5个种群44个单倍型聚为一支（Cluster1），河川沙塘鳢的12个种群115个单倍型序列可以聚为另外一大支（Cluster3），且2个大的聚类分支明显呈现出按不同地理区域分别聚类的现象，即Cluster1组群分布于长江中上游，Cluster3组群分布于长江中下游开阔的冲积平原。另外也可以看出，Cluster2组群是从Cluster3组群中细分出来的，Cluster2组群分布于淮河上游与长江中游的安徽巢湖、宣城以及黄山等地。Cluster2与Cluster3内部个体单倍型基因序列也出现了较少的不同地理区域交叉聚类的现象。
　　（4）种群遗传结构分析。17个种群间FST均较高（0.7325~0.7709）。AMOVA显示出17个种群被分为3组时遗传分化指数最高，且种群间的变异（0.7709）大于种群内个体间的变异（0.1992）（P<0.01），说明沙塘鳢属鱼类种群的遗传差异主要表现在种群间。单倍型最小跨度网络关系显示出：中华沙塘鳢与河川沙塘鳢经过了117次的变异才区分开来。
　　（5）中性检验分析与核苷酸错配分布分析，Cluster1、Cluster2与Cluster3的Tajima’s D依次为-1.2913（P>0.05）、-2.0365（P<0.05）和-2.6175（P<0.01），Fu’s FS值依次为-17.0490（P>0.05）、-23.1810（P<0.01）与-92.8640（P<0.01），Rg与R2全大于零（P>0.05），这些都显示出这三大聚类群经历了历史种群扩张事件。
　　（6）中华沙塘鳢与河川沙塘鳢的分界地理屏障可能是长江中游安徽境内的皖南山区（大别山和黄山）。“距离-隔离”模型检验结果显示，Cluster2种群间的地理距离(直线距离)和遗传距离[F’st/(1-F’st]的正相关性为Y(x)=0.0027*x+0.4104，分布斜率较小，Cluster2种群间内部遗传距离较小，分布较集中；相较而言，Cluster3种群间的地理距离和遗传距离的正相关性为Y(x)=0.0071*x+0.9465，分布斜率较大，Cluster3种群间内部遗传距离[F’st/(1-F’st]分布较广泛。
　　（7）沙塘鳢属鱼类的系统地理格局应该属于Avise系统地理格局中的第三或第五种：即不同种群系统发育关系连续，所属地理分布不同或部分连续，部分种群发生过种群替代现象，替代时间较短，尤其分布于长江中下游的河川沙塘鳢呈现出中度水平的基因交流，仅部分基因型具有广泛的地理分布格局，即共享单倍型种类较少。
　　4.基于微卫星标记的沙塘鳢属鱼类种群遗传多样性与种群遗传结构分析
　　（1）利用生物素标记-磁珠富集法开发中华沙塘鳢与河川沙塘鳢的微卫星分子标记，分别筛选出了13对和14对微卫星引物，依次用湖北荆州种群（JZ）和江苏苏州太湖种群（SZ）27尾个体与45尾个体进行分子标记多态性检测。
　　结果为：中华沙塘鳢，等位基因数目NA、多态信息含量PIC、观测杂合度HO和期望杂合度HE分别为6~21(平均14.2778)、0.7447~0.9303(平均0.8816)、0.3333~1.0000(平均0.5412)和0.7764~0.9518(平均0.8812)。有3个位点(O.sin7，O.sin13和O.sin17)显著偏离哈温平衡（HWE）(*P<0.05)，经Bonferroni矫正，13个微卫星位点间未发现连锁不平衡；河川沙塘鳢，等位基因数目NA、多态信息含量PIC、观测杂合度HO和期望杂合度HE依次为8~30(平均20.9286)、0.8020~0.9354(平均0.8962)、0.7500~1.0000(平均0.9508)和0.8436~0.9628(平均0.9101)，6个多态性微卫星位点(O.pot1，O.pot2，O.pot4，O.pot5，O.pot10 and O.pot14)偏离哈温平衡(*P<0.05)，经 Bonferroni矫正，14个微卫星位点间未发现连锁不平衡。本研究开发的两种鱼27对SSR引物的PIC值均较高，这对于进一步研究沙塘鳢属鱼类的遗传多样性与种群遗传结构意义重大，因为，更高的PIC值（PIC>0.5）相对而言能够提供更加丰富的遗传信息。
　　（2）对筛选的27对引物进行跨种扩增(Cross-species amplification)，得到可以同时稳定扩增两种沙塘鳢的适用性引物10对。应用于长江流域和淮河流域沙塘鳢属鱼类种群的遗传多样性与遗传结构分析。
　　结果为：
　　①遗传多样性分析，其中中华沙塘鳢与河川沙塘鳢平均等位基因数NA、平均等位基因丰富度AR、平均期望杂合度和观测杂合度（HE和HO）、平均多态信息含量PIC依次为10.6000与10.8333、8.2728与8.0890、0.9678与0.9600、0.9240与0.9143、0.8559与0.8546。各种群之间近交系数FIS变化范围为-0.0820~0.0690，平均近交系数为-0.0595，显示沙塘鳢种群偏向于随机交配。以上各指标均表明，长江流域沙塘鳢属鱼类野生种群的遗传多样性较丰富，且中华沙塘鳢种群的遗传多样性较河川沙塘鳢的稍高。
　　②种群的遗传结构和聚类分析，对于中华沙塘鳢和河川沙塘鳢而言，不同种群间的遗传距离变化范围分别为-0.0179~0.0413和0.0038~0.0943。AMOVA分析显示：组群间的遗传差异最小，组群内种群间的遗传差异最大。STRUCTURE聚类分析发现，长江流域及淮河流域的沙塘鳢属鱼类种群最佳分群为3组，Cluster1为YD种群、DY种群、JZ种群、HH种群与YT种群；Cluster2为LA种群、CH种群、XC种群与HS种群；Cluster3为HA种群、YZ种群、GY种群、JJ种群、SZ种群、HZJ种群、HZT种群与SH种群。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）结果也支持这种分类，同时也可以看出，LA种群和HS种群分布最远，揭示出这两种群相对于其他种群而言分化程度较大。
　　③种群的历史动态分析，BOTTLENECK瓶颈效应分析显示，长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类中华沙塘鳢5个种群均没有经历过瓶颈效应，而河川沙塘鳢中有4个种群可能经历过不连续的瓶颈效应。

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声明

上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1长江流域与淮河流域简介

2中华沙塘鳢与河川沙塘鳢研究概况

3 长江流域及淮河流域淡水鱼类的遗传多样性概况

4 长江流域与淮河流域淡水鱼类的亲缘地理学概况

5 种群遗传结构、遗传多样性形成机制和亲缘地理学研究中的相关理论

6 鱼类种群遗传学研究中常用分子标记

7 本研究的目的和意义

具体技术路线如下：

第二章 基于线粒体分子标记的长江流域沙塘鳢属鱼类的种群遗传多样性与遗传结构分析

第一节 长江流域沙塘鳢属鱼类线粒体全基因组基因结构比较

第二节 基于线粒体控制区的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类种群遗传多样性与遗传结构分析

第三章 基于核基因EPICs分子标记的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类的种群遗传多样性与种群遗传结构分析

1实验材料与方法

2 数据分析

3 结果

4讨论

第四章 基于微卫星标记的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类的种群遗传多样性、遗传结构及分子生物地理学研究

第一节 河川沙塘鳢与中华沙塘鳢微卫星引物的开发与筛选

第二节 基于微卫星标记的长江流域及淮河流域沙塘鳢属鱼类种群遗传多样性与种群遗传结构分析

全文小结

一、主要研究结果

二、创新点

三、不足点

四、下一步工作设想

参考文献

附件

附录

硕士在读期间科研与工作成果

致谢