饲料中补充益生菌对凡纳滨对虾生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响

摘要

第一部分：饲料补充蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长速度、抗病力及肠道微生物组成的影响。以基础饲料为空白组，在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌（B. cereus）活菌作为实验组，每组四个平行，在养殖场对凡纳滨对虾幼苗进行一个完整养殖周期的养殖试验。以此来研究外源补充蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长速率、抗WSSV感染的效果，以及对其肠道微生物组成的影响。将对虾防病益生菌制剂添加在基础饲料中制成活菌含量为108 CFU/g的免疫饲料。将养殖场中八个条件相同（相同光照、位置等）的养殖池分为两组，空白组投喂基础饲料，实验组投喂免疫饲料，养殖周期3个月，期间在第45d、52d、59d、66d、73d采样计算生长速率并取其肠道内容物，用16SrDNA序列V4区高通量测序方法检测对虾肠道内微生物群落的结构及变化情况。养殖第80天打包运回实验室暂养，共分三个组：实验组每日投喂免疫饲料，空白组、对照组投喂基础资料，暂养7天后进行WSSV攻毒实验，攻毒20天后结束养殖实验。结果显示：：（1）养殖试验结果表明投喂免疫饲料的实验组对虾生长速度比空白组快15.2%。（2）测序结果表明健康的凡纳滨对虾肠道微生态群落变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)含量高，厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）含量低；空白组变形菌门含量（68.30%）明显高于实验组含量（57.94%）；空白组拟杆菌门含量（23.58%）明显低于实验组含量(30.06%)。其中，变形菌门中以弧菌属、Anaerospora、小红卵菌属为主，空白组弧菌属占总含量的5.40%，实验组占总含量的1.94%；拟杆菌门中以Lutimonas、粘着杆菌属为主，实验组Lutimonas占总含量的5.56%，空白组占含量的8.12%。（3）攻毒试验表明在对两组攻毒后，实验组死亡率略低于空白组,差异不显著。本实验主要由养殖试验、高通量测序、攻毒实验等部分组成，为蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长速度的影响提供了依据，让人们了解了凡纳滨对虾肠道的微生物组成情况及蜡样芽孢杆菌对其微生物组成的影响，并分析了蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾抵抗WSSV的影响，为人们正确认识微生态制剂在水产上的应用提供一定的依据。 第二部分：饲料中补充蜡样芽孢杆菌生物膜对凡纳滨对虾生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响。为了研究外源补充蜡样芽孢杆菌生物膜对凡纳滨对虾生长及对其肠道微生物组成的影响，以基础饲料为空白组；在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌（Bacillus. cereus）游离态活菌作为游离态组(活菌含量为108CFU/g)；在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌活菌生物膜作为生物膜组(活菌含量108CFU/g)；每组八个平行，在实验室养殖大棚暂养一周后，对凡纳滨对虾进行40天的免疫实验。在第17天进行WSSV攻毒试验；第22天进行副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）攻毒试验。期间在第1d、5d、10d、15d采样，称重并测量体长计算生长速率。在第1d、5d、10d、15d、20d、25d采样，并取其肠道内容物提取DNA，用16SrDNA序列V4区高通量测序方法检测对虾肠道内微生物群落的结构及变化情况。结果显示：（1）生物膜组和游离态组对虾体重、体长增长速率高于空白组，生物膜组与游离态组对虾体重、体长差异性不显著，生物膜组和游离态组对虾体重、体长与空白组对虾差异性显著。（2）健康的凡纳滨对虾肠道微生物由变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝藻门（Cyanophyta）等组成，其中变形菌门平均占到总量的94%。（3）厚壁菌门在生物膜组和游离态组所占平均比例分别为0.45%、0.93%，远高于空白对照组的0.02%。（4）变形菌门中主要以弧菌属、发光杆菌属、Octadecabacter、假交替单胞菌属、褐杆菌属、Agarivorans等为主，生物膜组弧菌属含量平均为34.65%；游离态组弧菌属含量平均为39.27%；空白对照组弧菌属含量平均为58.00%。（5）在WSSV攻毒试验中，生物膜组平均累积死亡率为80%，游离态组平均累积死亡率为77%；空白对照组平均累积死亡率为92%；在副溶血弧菌攻毒试验中，生物膜组平均累积死亡率为61.3%，游离态组平均累积死亡率为75%；空白对照组平均累积死亡率为77.3%。研究结果提示：饲料中添加蜡样芽孢杆菌生物膜和游离态蜡样芽孢杆菌投喂凡纳滨对虾后可改变对虾肠道的微生物组成，提高对虾生长速度，增强凡纳滨对虾的抗病能力，而且添加蜡样芽孢杆菌生物膜效果更明显。 第三部分：饲料中补充多种有益菌生物膜对凡纳滨对虾生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响。为了研究外源补充多种芽孢杆菌生物膜对凡纳滨对虾生长、抗病力及对其肠道微生物组成的影响，以基础饲料为空白组；在基础饲料中添加蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus,菌株编号 PC070465）、坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus,菌株编号2011120102）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus,菌株编号2012071703）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus,菌株编号2012070203）、白翎芽孢杆菌（Bacillus baekryungensis,菌株编号201112010701）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium,菌株编号20120513-1-D-3）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,菌株编号2012071701）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis,菌株编号201112010602）游离态活菌作为游离态组(活菌含量均为106CFU/g)；在基础饲料中添加八株芽孢杆菌活菌生物膜作为生物膜组(活菌含量均为106CFU/g)；每组八个平行，在实验室养殖大棚暂养一周后，对凡纳滨对虾进行40天的免疫实验。在第17天进行WSSV攻毒试验；第22天进行副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）攻毒试验。在第10d、15d、20d、25d采样，并取其肠道内容物提取DNA，用16SrDNA序列V3+V4区高通量测序方法检测对虾肠道内微生物群落的结构及变化情况。结果显示：（1）实验对虾肠道内微生物主要由变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、蓝藻门、疣微菌门、泉古菌门、广古菌门等组成，其中变形菌门在总量上占据绝对优势。在副溶血弧菌攻毒后，空白对照组与生物膜组、游离态组肠道微生物组成差别较大，说明饲料中添加8株菌生物膜和8株游离态细菌能够使对虾肠道微生物组成更加稳定。（2）在WSSV攻毒试验中，饲料中生物膜组累计死亡率显著低于投喂8株游离态芽孢杆菌组和空白饲料组，且游离态组累积死亡率显著低于空白饲料组；在副溶血弧菌攻毒试验中，生物膜组累积死亡率显著低于游离态组和空白对照组，游离态组累积死亡率略低于空白对照组。研究结果提示：饲料中添加多种芽孢杆菌生物膜和多种游离态芽孢杆菌投喂凡纳滨对虾后可改变对虾肠道的微生物组成，增强凡纳滨对虾的抗病能力，而且添加多种芽孢杆菌生物膜效果更明显。

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第一章引言

1 益生菌的研究背景和定义

2 水生动物益生菌的筛选和保存

3 益生菌的作用机制

4 益生菌在肠道内的定植

5 存在的问题

第二章饲料补充蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长速度、抗病力及肠道微生物组成的影响

1材料与方法

2结果与分析

3结论

4讨论

第三章饲料中补充蜡样芽孢杆菌生物膜对凡纳滨对虾生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响

1材料与方法

2 结果与分析

3结论

4讨论

第四章饲料中补充多种有益菌生物膜对凡纳滨对虾生长、抗病力及其肠道微生物组成的影响

1材料与方法

2 结果与分析

3结论

4讨论

参考文献

致谢