一种南极鱼Ⅲ型抗冻蛋白抵抗低温分子机制的初步研究

摘要

鱼类的抗冻蛋白是由生活于极地海洋的鱼类产生，是能降低血液和体液冰点的一类蛋白。鱼类抗冻蛋白通过一个特殊的表面吸附于冰晶表面，抑制冰晶的生长。长期以来，人们认为抗冻蛋白只是一种与冰晶结合的蛋白，不具有其他的生物学功能。然而，近来通过转基因动物和植物的研究，证明一些抗冻蛋白在没有冰晶存在的低温状态下具有增强细胞和个体抵抗低温胁迫的分子生物学功能，并有望用于抗寒育种。本实验室在过去的研究中从南极鱼eelpout鉴定了一种具有四个结构域更高抵抗低温胁迫能力的Ⅲ型抗冻蛋白基因LD4。本项研究我们试图阐述LD4抵抗寒冷的保护机制。 首先，本研究从南极鱼Lycodichthys dearborni的多聚三型抗冻蛋白基因LD12 cDNA中克隆得到AFPⅢ的四聚体，命名为LD4，并构建真核表达质粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。将表达质粒转染到斑马鱼细胞系ZF4中。LD4可以在ZF4中大量表达并且能够减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。通过对相同培养条件的转染细胞和未转染的细胞进行转录组测序分析基因表达谱的变化。我们找到26个表达差异转录因子，其中I3MB13、ZNF687b等在LD4转染细胞中表达上调，JUN、Cremb等在LD4转染细胞中表达下调。这些表达差异显著的转录因子已经进行荧光定量PCR的验证。我们对这些转录因子进行KEGG pathway分析，结果发现，这些差异性基因主要参与细胞凋亡、细胞周期、增殖等调节信号通路。然后采用 Annexin V-PE/7-AAD双染色法对3种不同温度下的WT，EGFP和LD4细胞进行细胞凋亡检测，结果显示LD4在低温下与对照组（EGFP和WT）相比凋亡率没有显著差异，说明LD4可能是通过其他通路而不是单纯通过抑制细胞凋亡来抵御低温胁迫。这个研究提供了新的视角发现LD4抵御低温的分子机制。

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引言

第一章 绪 论

1.1 抗冻蛋白的结构及起源研究进展

1.2 抗冻蛋白的结构特征

1.2.1 抗冻糖蛋白

1.2.2 I型抗冻蛋白（AFPⅠ）

1.2.3 Ⅱ型抗冻蛋白（AFP Ⅱ）

1.2.4 Ⅲ型抗冻蛋白（AFP Ⅲ）

1.2.5 IV型抗冻蛋白（AFP IV）

1.3 抗冻蛋白的适应性调节

1.4 抗冻蛋白的应用

1.5 AFPⅢ抗冻蛋白的起源

1.6 抵御低温的信号通路

第二章 一种南极鱼Ⅲ型抗冻蛋白抵抗低温分子机制的初步研究

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 试剂及试剂盒

2.1.3 仪器

2.2 方法

2.2.1 Tol2-actin-MCS-2A-EGFP载体的示意图

2.2.2 构建载体中的引物设计

2.2.3聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）克隆目的基因

2.2.4 质粒的提取

2.2.5 质粒序列鉴定

2.2.6 ZF4斑马鱼成纤维细胞系培养

2.2.7 ZF4细胞系转染及稳定细胞系的获得

2.2.8 利用LD4抗体检测LD4在细胞中的表达

2.2.9 台盼蓝测细胞存活率

2.2.10低温处理后RNA sequence分析

2.2.11流式细胞仪进行凋亡检测

2.2.12 LD4蛋白在细胞中的定位

2.2.13 qPCR检测转LD4斑马鱼细胞系中转录因子表达差异

2.3 结果分析

2.3.1 真核表达质粒的构建及鉴定

2.3.2 表达载体转染斑马鱼细胞及蛋白表达

2.3.3 台盼蓝测定低温处理后存活率的结果

2.3.4 转录组测序结果分析及实时定量PCR鉴定

2.3.5 用流式检测凋亡的分析结果

2.4 讨论

2.5 结论

参考文献

致谢