养殖牡蛎中贝类毒素污染监测和预警技术研究

摘要

我国是贝类产品养殖、生产大国，2014年牡蛎养殖面积已达12万公顷，总产量超过380万吨，已经占全球牡蛎总产量的80.37%。太平洋牡蛎（Ostrea gigas）、近江牡蛎（Ostrea rivularis）、大连湾牡蛎（Ostrea talien whanensis）、褶牡蛎（Ostrea plicatula）为我国主要牡蛎养殖品种。近年来，随着我国经济的飞速发展，大量污染物质被排放到海洋生态系统中，导致水体富营养化现象严重，有害赤潮现象频发，有毒有害藻类的繁殖所产生的毒素可在贝类体内富集，通过食物链传递，不仅直接危害消费者身体健康，也会对水产品养殖加工带来损失。目前，我国在贝类毒素的检测和控制技术方面的研究存在一定局限性，缺少对海洋环境和生物体内贝类毒素消长变化的系统研究，也未能形成一套行之有效的贝类毒素污染预警与控制技术。 本研究针对养殖区中牡蛎和海水环境，利用高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）分别建立了检测五种腹泻性贝类毒素（OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2）和六种麻痹性贝类毒素（STX、dcSTX、GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4）的方法；根据固相毒素跟踪技术（Solid Phase Adsorbent and Toxin Tracking，SPATT）原理，利用HP20大孔型吸附树脂、SP700型树脂分别建立了富集海水中腹泻性与麻痹性贝类毒素的方法；基于已建立的毒素检测和富集方法，采集养殖区中牡蛎与海水样品，同步监测养殖海域内牡蛎与海水中毒素含量，探究两者之间的关系，建立牡蛎内贝类毒素含量随海水内贝类毒素含量之间的变化规律，具体研究内容和主要结论如下： 1.优化了高效液相色谱-串联质谱法测定牡蛎内腹泻性贝类毒素的方法并建立了海水中腹泻性贝类毒素的富集与检测方法。牡蛎组织中五种腹泻性贝类毒素经80%甲醇水提取，MAX阴离子固相萃取柱净化，MGII C18分离色谱柱分离，选择反应监测模式下正负电喷雾离子源交替扫描。结果表明，常见的五种腹泻性贝类毒素 OA、DTX-1、DTX-2在负源下响应较高，GYM、PTX-2在正源下响应灵敏度高，线性范围良好，R≥0.99，加标回收率均在83.7~103.2%（n=6）之间，相对标准偏差（RSD）介于3.8~9.2%，OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2的定量限为分别为1.5μg/kg，0.7μg/kg，1.2μg/kg，2.1μg/kg，0.6μg/kg。腹泻性贝类毒素利用HP20大孔型吸附树脂进行富集，树脂袋放置于海水中一周后取出，树脂经甲醇洗脱，二氯甲烷净化后，检测其中五种腹泻性贝类毒素的含量。实验结果表明，HP20对五种腹泻性贝类毒素有很强吸附能力，吸附回收率均在62.8~101.3%之间，五种腹泻性贝类毒素OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2的定量限分别为5.2μg/20g resin*week，6.1μg/20g resin*week，4.5μg/20g resin*week，8.3μg/20g resin*week，7.4μg/20g resin*week。 2．同步采集牡蛎与海水样品，检测腹泻性毒素含量，监测其变化特征并研究两者之间的变化规律。实验结果显示，五种腹泻性贝类毒素中，除DTX-2在海水和牡蛎中都未能检测到之外，其余四种均有检出。海水中毒素含量的变化随温度的变化较为明显，随环境温度的升高，海水中毒素含量升高，峰值集中出现在8月份，而后呈下降趋势；但台风等剧烈环境变化后，海水中腹泻性贝类毒素含量有剧烈增高现象；在空间分布上，采样表层海水中毒素含量均值大于中层含量大于下层含量，在每年8-9月份，该现象最显著。牡蛎体内四种腹泻性贝类毒素含量均较低，其变化规律与海水中毒素含量呈现正相关关系，即海水中毒素含量增高时，牡蛎内毒素含量也呈现上升趋势，牡蛎中毒素含量达到峰值时间比海水中毒素含量达到峰值时间延后一到两个采样周期（一个采样周期为7天），随着海水环境中毒素含量的下降，牡蛎内毒素含量也开始下降，但其下降趋势较海水中缓慢。 3.建立了高效液相色谱-串联质谱法测定牡蛎内麻痹性贝类毒素的方法和海水中麻痹性贝类毒素的富集与检测技术。牡蛎组织中麻痹性贝毒由1‰甲酸水溶液提取，净化后经Amide-80色谱分析，乙腈与水溶液（含1‰甲酸和2mM甲酸铵）作为流动相梯度洗脱，电喷雾离子源正离子选择反应监测模式质谱扫描。结果显示，常见的六种麻痹性贝类毒素响应灵敏度高，线性范围良好，R≥0.99，毒素STX，dcSTX，GTX-1、4，GTX-2，GTX-3的定量限分别为7.6μg/kg，17.3μg/kg，35.5μg/kg，25.8μg/kg，21.5μg/kg。在牡蛎空白样品中添加六种麻痹性贝类毒素高中低三个不同浓度水平混标，其回收率均在63.7~79.1%（n=6），相对标准偏差（RSD）为7.2~12.6%。利用SP700树脂富集海水中麻痹性贝类毒素，毒素经1‰甲酸水溶液提取后，HLB固相萃取小柱净化，用已建立的检测方法测定含量。实验结果显示，树脂在一个采样周期内六种常见的麻痹性贝毒吸附回收率在60.9%~81.5%，毒素STX，dcSTX，GTX-1、4，GTX-2，GTX-3在树脂中的定量限分别为10μg/20g resin*week，20μg/20g resin*week，45μg/20g resin*week，30μg/20g resin*week，25μg/20g resin*week，满足实验要求。 4.同步采集牡蛎与海水样品，监测其中麻痹性毒素含量，探究其变化特征并研究两者之间的变化规律。实验结果显示麻痹性贝毒 STX、dcSTX在监控海域内有检出，其他毒素未检出，在时间分布上，其峰值出现在8月下旬，随时间变化规律上同腹泻性贝类毒素类似，也是呈现先增加后降低趋势。在牡蛎中，可检测到STX存在，其含量随海水中毒素含量变化呈现正相关性，峰值出现的时间差为2个采样周期，且降解速度缓慢，其他五种麻痹性贝类毒素在采样海域养殖牡蛎中未检出。

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第一章 引言

1.1贝类毒素概述

1.2贝类毒素检测方法

1.3贝类毒素监控与预警技术

1.4本课题研究意义

第二章 牡蛎和海水中五种腹泻性贝毒检测方法的优化与建立

2.1牡蛎内五种腹泻性贝类毒素检测方法的优化

2.2海水内五种腹泻性贝类毒素富集方法的建立与监测

2.3本章小结

第三章 腹泻性贝类毒素在海水与牡蛎内变化特征与预警

3.1材料与方法

3.2结果与结论

3.3 本章小结

第四章 牡蛎和海水中六种麻痹性贝毒检测方法的优化与建立

4.1 牡蛎内六种麻痹性贝类毒素检测方法的建立

4.2海水中六种麻痹性贝类毒素富集方法的建立与监测

4.3 本章小结

第五章 海水中麻痹性贝类毒素富集方法的建立与预警

5.1实验方法

5.2 结果与讨论

5.3本章小结

第六章 总结与展望

6.1 主要结论

6.2 展望

参考文献

致谢