鲤鱼TLRs功能及鲤春病毒血症病毒感染后免疫相关基因应激表达机制的研究

摘要

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是识别病毒病原相关分子模式（Pattern associated molecular patterns，PAMPs）的主要模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs），其识别病毒PAMPs后，通过依赖MyD88（Myeloid differentiation factor88，MyD88）或TRIF（TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β，TRIF）信号传导通路，诱导核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）和干扰素调节因子（Interferon regulatory factors，IRFs）的表达，启动固有免疫和适应性免疫而抵御病毒入侵。至今在硬骨鱼类中已鉴定了20种TLRs，大多数鱼类TLRs能在哺乳动物中找到直系同源物；但有研究表明，鱼类与哺乳类的TLRs功能发生了分化。 鲤春病毒血症病毒（Springviremia ofcarpvirus，SVCV）是一种弹状病毒，可引起鲤科鱼类及鲶科鱼类大规模暴发鲤春病毒血症（Springviremia ofcarp，SVC）。SVC传染快、死亡率高，可造成巨大的经济损失，已成为鲤科鱼类养殖的最大威胁。鲤科鱼类是我国淡水养殖的主要品种，产量占淡水养殖的20%以上；其中鲤鱼正是SVCV主要的、最易感的宿主，但目前关于鲤鱼抗病毒（SVCV）固有免疫应答的知识非常有限。 因此，本论文以鲤鱼为研究对象，对与病毒先天性识别有关的TLRs及其下游信号通路中的干扰素相关免疫因子展开研究；并在建立鲤鱼-SVCV感染模型的基础上，从分子角度研究SVCV引起的宿主TLRs、非特异性免疫相关基因和炎症相关基因表达量的变化，了解鲤鱼抗SVCV免疫应答的分子机制，为SVC的免疫防治提供理论指导。 第一部分鲤鱼抗病毒相关TLRs功能的研究 首先应用RT-PCR技术扩增获得鲤鱼TLR2、TLR3、TLR7、TLR9和TLR22基因（CcTLRs），并将它们克隆入真核表达载体pEGFP-N1构建过表达质粒；然后将过表达质粒 pEGFP-N1-CcTLRs和空载体质粒 pEGFP-N1同时转染鲤鱼上皮瘤（Epithelioma papulosum cyprinid，EPC）细胞，采用实时荧光定量PCR检测转染pEGFP-N1-CcTLR2、pEGFP-N1-CcTLR9和pEGFP-N1后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h细胞内IRF3和IRF7以及干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs） ISG15、Mx1、PKR和 Viperin（Vig1）的 mRNA转录水平，以及转染pEGFP-N1-CcTLR3和pEGFP-N1-CcTLR7后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h细胞内IRF3和IRF7的mRNA转录水平；并通过SVCV感染实验探索了TLR2在EPC细胞中过表达激发的抗病毒效应。结果显示： 在EPC细胞中转染pEGFP-N1-CcTLR2后IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的mRNA转录水平均出现明显上调，在转染后48 h，其转录水平分别相当于转染前的6.3倍、16.5倍、15.0倍、13.0倍、7.6倍和92.4倍，差异极显著（P<0.01）；与转染pEGFP-N1相比，转染pEGFP-N1-CcTLR2的EPC细胞IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的mRNA转录水平在转染后48 h和72 h分别上调2倍和2.2倍、1.5倍和2.4倍、3.9倍和4.7倍、3.4倍和6.7倍、5.4倍和3.7倍、6.6倍和15.6倍，差异极显著（P<0.01）；转染pEGFP-N1组在感染SVCV后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的病毒量分别是转染pEGFP-N1-CcTLR2组的1.1倍、2.4倍、3.8倍、11.7倍和11.4倍，差异极显著（P<0.01）。因此，鲤鱼TLR2在EPC细胞中过表达可上调 IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin基因的mRNA转录水平，以及抑制SVCV的增殖；提示鱼类TLR2可通过激活IRF3或/和IRF7信号通路诱导I-IFN的产生，进而诱导ISG15、Mx1、PKR和Viperin等干扰素刺激基因表达抗病毒蛋白发挥抗病毒免疫效应。 在EPC细胞中转染pEGFP-N1-CcTLR9后IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的mRNA转录水平均出现明显上调，在转染后72 h，其转录水平分别相当于转染前的6.9倍、39.5倍、65.7倍、5.0倍、5.6倍和156.2倍，差异极显著（P<0.01）；与转染pEGFP-N1相比，转染pEGFP-N1-CcTLR9的EPC细胞IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和Viperin的mRNA转录水平在转染后48 h和72 h分别上调1.3倍和2.5倍、2.8倍和3.1倍、5.9倍和10.3倍、3.0倍和1.9倍、2.3倍和2.6倍、6.5倍和11.9倍，差异极显著（P<0.01）。研究表明，鲤鱼TLR9在EPC细胞中过表达可上调 IRF3、IRF7、ISG15、Mx1、PKR和 Viperin基因的 mRNA转录水平，其中Viperin、ISG15和IRF7上调较明显，PKR上调幅度最小；提示鱼类TLR9具有哺乳动物TLR9相似的功能，能通过激活IRF7信号通路诱导I-IFN的产生，进而诱导ISG15、Mx1和Viperin等干扰素刺激基因表达抗病毒蛋白发挥抗病毒免疫效应。 在EPC细胞中分别转染pEGFP-N1-CcTLR3和pEGFP-N1-CcTLR7，IRF3和IRF7的mRNA转录水平与转染前相比虽有上调，但与转染pEGFP-N1相比，差异不显著（P?0.05），说明鲤鱼TLR3/TLR7在EPC细胞中过表达对IRF3和IRF7基因的mRNA转录没有明显影响。此外，在本研究中没有克隆到鲤鱼TLR22。 第二部分鲤鱼免疫相关基因对SVCV感染的应激表达机制研究 通过对鲤鱼注射低于致死剂量的SVCV（实现了较低的死亡率），研究每条鱼Toll样受体通路中从模式识别受体到抗病毒基因的各免疫相关基因应激表达情况。这包括（1）Toll样受体：TLR2、TLR3和TLR7；（2）干扰素调节因子：IRF3和IRF7；（3）干扰素基因：IFNa1、IFNa2和IFNa1S；（4）干扰素刺激基因：ISG15、Mx1、Vig1、PKR和ADAR；（5）促炎性细胞因子：IL1β、IL6和IL10。结果显示： SVCV在3 hpi就开始在宿主细胞中复制，6 hpi病毒数量开始激增，至3 dpi达到最大值；在5 dpi，病毒复制开始减少，但10 dpi病毒载量依然处在一个较高水平。感染后同一时间点不同样本体内病毒量变化很大，且发现多数样本组有一个病毒复制水平高的样本（33%），这个比例与死亡率相近，由此推测携带病毒多的鱼在感染后期会死亡。 鲤鱼头肾中TLRs及其信号通路中免疫相关基因表达量的变化如下：（1）TLR2、TLR3和TLR7的转录水平在3 hpi就开始出现上调，且分别在3 dpi、12 hpi和1dpi达到高峰；随后开始下降，至10 dpi，3个TLRs的转录仍处在一个低水平的上调。（2）IRF3和IRF7的转录水平在3 hpi就开始出现上调，且分别在1dpi和3 dpi达到高峰；随后，IRF3和IRF7的转录水平开始逐渐下降，但一直处于上调状态；且IRF7的上调幅度比IRF3明显，至10 dpi，仍处于较高的转录水平。（3）IFNa1和IFNa2的转录水平在12 hpi出现明显上调，并在3 dpi达到高峰，但IFNa1S的转录水平一直很低；在5 dpi和7dpi时，IFNa1和IFNa1S的转录水平与对照组相似，而IFNa2一直处在一个较高水平的上调。（4）ADAR、ISG15、Mx1、PKR和Vig1的转录水平在12 hpi开始出现明显上调；其中ADAR、ISG15和PKR在1 dpi上调达到高峰，3 dpi后开始逐渐下降，但在整个实验期间仍保持上调状态；Mx1和Vig1在1 dpi和3 dpi高水平上调表达并达到高峰，在5 dpi减少，但表达水平仍相对较高。（5）IL1β、IL6和IL10的转录水平在3hpi和6 hpi时出现下调，但在12 hpi和1 dpi时上调至较高水平；随后IL6和IL10出现下调，而IL1β则一直保持上调状态。从上述研究结果看，各免疫相关基因可受病毒刺激而上调表达，表达量基本与体内病毒量成正比。 综上，鲤鱼感染SVCV后，病毒在很短的时间内开始在宿主细胞中复制，并以指数速率增加；病毒感染早期，TLR2、TLR3和TLR7迅速上升到一个比较高的水平，启动免疫刺激信号，刺激IRFs、I-IFNs和ILs的表达；在病毒感染的中后期，ADAR、ISG15、Mx1、PKR和Vig1等干扰素刺激基因大量表达发挥抗病毒免疫效应。因此，SVCV（弹状病毒）可以刺激机体上调先天性免疫因子的表达以抵抗病毒，且主要以I-IFNs介导的抗病毒免疫应答为主，即TLR2、TLR3和TLR7识别病毒后可能能够通过IRFs/ I-IFNs/ ISGs信号途径激活抗病毒反应。

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引言

第一章 文献综述

1.1 模式识别受体和病原相关分子模式

1.2 TLRs介导的抗病毒反应

1.3 鱼类免疫相关基因研究进展

1.4 鲤春病毒血症病毒的危害

1.5 本研究的内容和意义

第二章 鲤鱼抗病毒相关TLRs介导I-IFN产生的初步研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3讨论

2.4 小结

第三章 鲤鱼TLR2过表达对下游干扰素刺激基因表达的影响

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

3.3讨论

3.4 小结

第四章 鲤鱼TLR9过表达对下游干扰素刺激基因表达的影响

4.1材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 鲤鱼免疫相关基因对SVCV感染的应激表达机制研究

5.1材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

全 文 结 论

参考文献

附录A 缩略词表

附录B 攻读博士学位期间发表的研究论文

致谢