中华绒鳌蟹断肢再生的生产性能评估与基因表达谱分析

摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）和其他蟹类一样，具有强大的断肢再生能力，在肢体再生生物学研究上具特有优势。本文采用养殖生物学、分子生物学、生物信息学等研究手段，在实验室及室外养殖条件下，对中华绒螯蟹断肢仔蟹和成蟹进行了生长性能评估，并对肢体再生不同阶段进行了比较转录组研究，探讨了中华绒螯蟹肢体再生的基因表达谱和分子机制，结果如下： 一、断肢再生对中华绒螯蟹仔蟹蜕壳、生长及相关基因表达的影响 以中华绒螯V期仔蟹为材料，研究了人工压力法切断其4个步足（左侧第1、3步足和右侧第2、4步足）后的蜕壳、生长与相关基因的表达规律。两个蜕壳周期的分析发现：断肢蟹当期蜕壳的步足再生率为7.6%，第二次蜕壳后的再生率为91.6%；断肢蟹与正常蟹的成活率无显著差异（P>0.05）；断肢蟹在断肢当期的蜕壳周期要显著长于正常蟹（P<0.01），但蜕壳后增重率显著高于正常蟹（P<0.05），而第二次的蜕壳周期要显著短于正常蟹（P<0.01），但蜕壳后增重率与正常蟹无显著差异（P>0.05）；经两次蜕壳后，断肢蟹与正常蟹在整体蜕壳周期上不存在显著差异（P>0.05）。相关基因表达差异分析表明：断肢蟹与正常蟹在胰岛素样生长因子（IGF2）、维甲类X受体（RXR）、蜕皮抑制激素（MIH）三个基因的表达上无显著差异（P>0.05）；但断肢蟹的蜕皮激素受体（EcR）基因的表达量显著高于正常蟹（P<0.05），而肌肉生长抑制素（MSTN）基因的表达量却显著低于正常蟹（P<0.05）。综合表明：中华绒螯蟹仔蟹发生断肢后，能在两个蜕壳周期完成再生，且与正常蟹在成活率、蜕壳周期和蜕壳后增重率上无显著差异；EcR和 MSTN基因对促进中华绒螯螯再生肢体的生长发育有重要作用；断肢仔蟹可在生产上继续使用。 二、二龄中华绒螯蟹断肢再生的生长性能评估和遗传生理分析 在室外水泥池条件下研究了不同断肢数量（去两步足、去三步足和未去步足）对中华绒螯蟹二龄成蟹养成阶段生长及生理的影响。自断肢后三个蜕壳周期的研究发现：断肢对二龄蟹的生长影响较大，表现在生长上：三个蜕壳周期后，成活率显著降低，去三步足（24.3%）＜去两步足（41.0%）＜未去步足（50.8%）（P＜0.01）；每次蜕壳后性状均值（体重、壳长、壳宽）显著降低，去三步足＜去两步足＜未去步足(P＜0.01)；第三次蜕壳后去步足蟹（去两步足和去三步足）的肥满度显著低于未去步足蟹（P＜0.05）；第一次蜕壳后断肢蟹性状增长率（体重、壳长和壳宽）显著低于正常蟹（P＜0.05），而第二、三次蜕壳后断肢蟹又显著高于正常蟹（P＜0.05）。表现在遗传与生理上：血淋巴中的蜕皮激素含量在每次蜕壳后的组间无显著差异（p＞0.05）；肌肉抑制基因（MSTN）在再生肢体中显著低表达（P＜0.01）；胰岛素样生长因子2（IGF-2）和蜕皮抑制激素基因（MIH）在断肢蟹和正常蟹中无表达差异（P＞0.05）。综合研究表明：中华绒螯蟹二龄成蟹养殖阶段发生的断肢对生长具有不利影响，虽然在肢体再生后断肢蟹表现出一定程度的补偿生长效应，但其补偿能力有限。生产上我们建议养殖户挑选健壮且肢体完整的扣蟹进行成蟹阶段的养殖。 三、中华绒螯蟹不同断肢再生阶段的比较转录组分析 应用高通量测序技术获得了断肢蟹与正常蟹在肢体再生的三个阶段：伤口形成阶段（断肢后24小时）、肢芽形成阶段（断肢后13天）、新肢发育阶段（第二次蜕壳后0小时）的眼柄和断肢基部肌肉的转录组数据。De novo拼接的河蟹转录组含有66333个转录本，其中30949个转录本能被NCBI-NR数据库注释，26030个能被Uniprot数据库注释。差异表达基因分析发现，伤口形成阶段共有583个差异表达基因，其中539个基因在断肢蟹中高表达，44个基因在正常蟹中高表达；在肢芽形成阶段共有2262个差异表达基因，其中1806个基因在断肢蟹中高表达，456个基因在正常蟹中高表达；在新肢发育阶段共有241个差异表达基因，其中167个基因在断肢蟹中高表达，74个基因在正常蟹中高表达。功能富集分析表明，断肢再生不同阶段肢体发育模式具有差异，伤口形成阶段主要为免疫响应，肢芽形成阶段主要为肢芽形态发生，新肢发育阶段主要为新肢生长。此外，Wnt和Notch通路在断肢再生过程的激活体现了其在断肢再生过程中的必要性。综合研究表明：断肢再生是是一个复杂的生物学过程，断肢再生不同发育阶段的基因表达模式体现了中华绒螯蟹的免疫响应、肢芽形态发生以及新肢生长的分子机制。

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引言

1.论文背景

2. 本论文主要研究内容与技术路线：

第一章 断肢再生对中华绒螯蟹仔蟹蜕壳、生长及相关基因表达的影响

1 材料和方法

1.1 试验材料与饲养管理

1.2 生长测定与组织采集

1.3 相关基因表达分析

1.4 数据处理

2 结果

2.1增重率差异

2.2 蜕壳周期差异

2.3 基因表达差异

3 讨论

第二章 二龄中华绒螯蟹断肢再生的生长性能评估和遗传生理分析

1 材料和方法

1.1试验材料与研究方法

1.2数据处理

2 结果

2.2二龄中华绒螯蟹断肢再生的生长性能评估

2.2断肢对中华绒螯蟹血淋巴中蜕皮激素含量的影响

2.3断肢再生对相关基因表达的影响

3 讨论

第三章 中华绒螯蟹不同断肢再生阶段的比较转录组分析

1 材料方法

1.1样本采集

1.2 RNA的提取以及转录组测序文库的构建

1.3 原始数据的过滤与转录组拼接

1.4 转录组的注释

1.5 差异表达分析

2 结果

2.1转录组拼接和注释

2.2差异表达基因聚类分析

2.3差异表达基因功能富集

2.4 断肢再生相关通路注释

2.3 断肢再生不同发育阶段差异表达基因

3讨论

3.1 中华绒螯蟹的体液免疫机制

3.2 肢体再生的形态发生机制

3.3 再生肢体和正常肢体发育模式差异

3.4 断肢再生和早熟蜕壳的可能分子机制

3.5 中华绒螯蟹肢体再生相关通路

小结

一、主要结果：

二、下一步工作设想：

参考文献

致谢