草鱼CTGF、ROCK1基因克隆及投饲蚕豆对草鱼胶原蛋白基因和TGFβ1-CTGF信号通路的影响

摘要

实验一：草鱼CTGF基因的全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达
　　CTGF（Connective tissue growth factor）是即结缔组织生长因子，参与细胞增殖、迁移、粘合和细胞外基质的形成，在胚胎发生、血管生成、伤口修复及纤维化疾病的发生中发挥着重要作用。本实验采用cDNA末端快速扩增法首次克隆获得草鱼CTGF基因全长序列，对其编码蛋白质序列的特性进行预测和分析，并采用实时荧光定量PCR法检测草鱼各组织CTGF基因的差异表达。结果表明，草鱼CTGF基因全长2223 bp，所编码343个氨基酸；草鱼CTGF基因编码的氨基酸序列与团头鲂、斑马鱼、鲤鱼、墨西哥脂鲤CTGF的氨基酸序列同源性分别达98％、96%、91%、91%；生物信息学分析显示草鱼CTGF蛋白分子量为37978.2，理论等电点为8.22，为亲水性分泌蛋白，在多肽链1-21氨基酸残基段存在信号肽；其二级结构包括α-螺旋（α-helix）、β-重叠股（β-strand）和环（loop）。组织差异性表达分析显示CTGF基因在肌肉、皮肤、肝脏、心脏、脑、鳃、前肠、血液和脾脏均有表达，其中在血液和脾脏中表达量最高，心脏和鳃组织次之，皮肤、肌肉、肾脏、脑和前肠组织表达量较低，肝脏组织中的表达量最低。
　　实验二：草鱼ROCK1基因的全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达
　　ROCK1是Rho激酶（ROCK）家族的成员之一，ROCK家族是Rho蛋白的下游效应因子，被Rho蛋白激活后ROCK作用于下游的效应分子，对其介导的信号通路进行调节，参与细胞增殖、迁移、形态改变等。在组织纤维化、癌症、心血管等疾病中发挥着重要作用。本实验采用cDNA末端快速扩增法首次克隆获得草鱼ROCK1基因全长序列，对其编码蛋白质序列的特性进行预测和分析，并采用实时荧光定量PCR法检测草鱼各组织ROCK1基因的差异表达。结果表明，草鱼ROCK1基因全长4604 bp，编码1361个氨基酸；草鱼ROCK1基因编码的氨基酸序列与金线鲃、斑马鱼、鲤鱼ROCK1的氨基酸序列同源性分别达95%、94%、94%；生物信息学分析显示草鱼ROCK1蛋白分子量158035.73，理论等电点5.69，为亲水性非分泌蛋白，不存在信号肽；其二级结构包括α-螺旋（α-helix）、β-重叠（β-strand）和环（loop）。组织差异性表达分析显示ROCK1基因在肌肉、皮肤、肝脏、心脏、脑、鳃、前肠、血液和脾脏均有表达，其中在脑和血液中表达量最高（P＜0.05），其次为鳃、心脏、肾脏、脾脏和前肠组织，肌肉和肝脏组织表达量较低，皮肤组织表达量最低。
　　实验三：投饲蚕豆对草鱼肌肉和皮肤组织TGFβ1-CTGF信号通路及胶原基因表达的影响
　　本实验以投喂配合饲料的草鱼为对照组，以干蚕豆浸泡24h后投喂的草鱼为实验组（也称蚕豆组），对两组鱼进行为期12周的养殖，并分别于0周、4周、8周和12周采集肌肉和皮肤组织，采用荧光定量法测定蚕豆组和对照组肌肉和皮肤组织TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1及COL1A2基因的时空表达。结果显示，蚕豆组皮肤和肌肉组织TGFβ1、CTGF、COL1A1及COL1A2基因4个时期的表达量变化趋势一致，均在4周达到最高且显著高于对照组，8周和12周时则显著降低。蚕豆组肌肉组织 ROCK1基因在4周时的表达量达到最高，但4周、8周和12周的表达量均低于对照组，而皮肤组织ROCK1在4周、8周和12周逐渐降低，且均低于对照组。蚕豆确实影响了草鱼TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1和COL1A2的表达，TGFβ1、CTGF和ROCK1基因参与调控COL1A1和COL1A2的表达。由结果推测认为蚕豆饲喂前期可能通过促进TGFβ1-CTGF信号通路刺激TGFβ1、CTGF的高表达，进而促进胶原蛋白的合成；同时蚕豆饲喂后期可能抑制了ROCK1的表达，进而其对TGFβ1-CTGF信号通路的促进作用减弱，表现为后期胶原蛋白合成的降低，相关分子调控机制值得进一步深入研究。

目录

声明

第一章 文献综述

1胶原蛋白概述

2肌肉胶原蛋白的研究现状

3胶原合成相关基因调控

4蚕豆对肌肉胶原合成以及肉质的影响

5小结

第二章 草鱼CTGF基因的全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第三章 草鱼ROCK1基因全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达

1材料与方法

2 结果

3讨论

4 结论

第四章 投饲蚕豆对草鱼肌肉和皮肤组织TGFβ1-CTGF信号通路及胶原基因表达的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢