凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病致病原分析及防控技术研究

摘要

对虾急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND）致病性强、死亡率高、传播范围广，是目前危害对虾养殖最严重的疾病之一。2009年以来急性肝胰腺坏死病在全国沿海地区的对虾养殖主产区频繁发生，其排塘率高达80％以上，对我国对虾产业影响深重，造成巨大经济损失。
　　本实验旨在通过以口服细菌的方法进行人工感染实验，分析了从患病对虾病灶处分离的五株潜在致病菌的致病力，确定了四株细菌为凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的致病原；同时，研究了四种消毒剂对四种病原菌的杀灭浓度、杀灭时间及杀灭率的关系，筛选出一种高效、绿色消毒剂聚六亚甲基胍（PHMG）；应用候选高效抗菌素“HPP-1”（20%氟苯尼考）和PHMG，建立对虾养殖系统内弧菌的定量化控制技术，在全国沿海多地对虾主产区进行AHPND的预防及治疗中试实验。
　　1、五株急性肝胰腺坏死病潜在致病菌的致病力分析
　　课题组在浙江、江苏、山东、河北、天津等地患 AHPND对虾病灶处分离五株优势菌株 PV130715A、PV130903A、PV140731A、PV150526A、PV140821A，利用早期分离的上述五株细菌分别以口服方法进行人工回接感染实验。以5.89～58915.94cell/g对虾的总细菌数量，通过连续口服3d含菌饵料（每天一次）的方法统计分析凡纳滨对虾累积死亡率及感染对虾的发病症状，对五株潜在致病菌的致病力进行了分析。结果显示，经人工回接感染证实，其中四株细菌可引起健康对虾致病，其感染症状与自然发病的AHPND典型症状相似；并从感染对虾病灶处重新分离出四株优势菌株PV130903B、PV140731B、PV150526B、PV140821B，通过生理生化及16S rDNA分子鉴定表明PV130903A与PV130903B为同一株菌，鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）；PV140731A与PV140731B为同一株菌，鉴定为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）；PV150526A与PV150526B为同一株菌，鉴定为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）；PV140821A与PV140821B为同一株菌，鉴定为Vibrio sp.Ex25。根据科赫法则、发病症状、病理特征，确定了副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25是AHPND的致病原。按照寇氏法则计算这四株病原菌的LD50分别为1.8×105cfu/g、8.5×104cfu/g、2.3×105cfu/g和2.9×105cfu/g。对凡纳滨对虾而言，哈维氏弧菌的致病力高于副溶血弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25。而PV130715A是嗜水气单胞菌，并非AHPND的致病原。
　　2、几种消毒剂对养殖对虾急性肝胰腺坏死病致病菌的杀灭实验研究
　　笔者对分离鉴定的副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25四株致病菌进行了定性及定量杀菌实验，研究了聚六亚甲基胍（PHMG）、双氧水（H2O2）、聚维酮碘（PVPI）及二氧化氯（ClO2）四种消毒剂对四株致病菌的杀灭浓度、杀灭时间及杀灭率的比较分析。结果表明，在24h内的杀菌浓度上，浓度为0.5μl/L的PHMG可将副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp.Ex25三株细菌全部杀灭，浓度为1μl/L的PHMG可将四株细菌全部杀灭；浓度为0.5μl/L的双氧水可将Vibrio sp.Ex25杀灭，浓度为1μl/L的双氧水可将四株病原菌全部杀灭；浓度为6μl/L的聚维酮碘可将副溶血弧菌、Vibrio sp.Ex25杀灭，浓度为8μl/L的聚维酮碘可将四株细菌全部杀灭；浓度为2μl/L的二氧化氯可将四株细菌全部杀灭。在杀菌时间上，10min内，PHMG和双氧水杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp.Ex25的最低浓度均为1μl/L，二氧化氯杀灭副溶血弧菌、哈维氏弧菌、Vibrio sp.Ex25的最低浓度为2μl/L，而聚维酮碘需高达10μl/L才能完全杀灭四种细菌；在1h内，浓度为2μl/L的二氧化氯可完全杀灭四种细菌；在2h内，浓度为1μl/L的PHMG和双氧水可完全杀灭四种细菌。随着时间的推移，PHMG和聚维酮碘显示出持续杀菌的能力，杀菌率随时间的推移逐渐升高，双氧水和二氧化氯的杀菌率在达到峰值之后均有不同程度的下降，浓度越高，其到达峰值杀菌率的时间越短。综合比较分析，这四种消毒剂对AHPND致病菌的杀菌能力强弱为PHMG＞双氧水＞二氧化氯＞聚维酮碘。结合消毒剂的杀菌浓度、杀菌效果、持续时间及使用成本等几个方面考虑，认为PHMG具有绿色、安全、高效等优点，在水产养殖中将会有良好的应用前景。
　　3、候选药物对养殖系统内弧菌的杀灭效果及养殖应用示范
　　本研究采用口服专用药物“HPP-1”杀灭对虾肝胰腺弧菌和泼洒水体消毒剂聚六亚甲基胍（PHMG）杀灭养殖水体中弧菌相结合的方法，在天津、河北、江苏、浙江、山东等多地的12处养殖场进行了AHPND的预防及治疗中试实验。结果显示：在疾病预防实验中，PHMG在0.5μl/L浓度作用下弧菌总量第4d下降到最低值，下降总量为初始值的80.84%；PHMG在1μl/L浓度下第3d弧菌总量下降到最低值，下降总量为85.67%；PHMG在2μl/L浓度下第第3d下降到最低值，下降总量为88.60%；在治疗实验中，PHMG在0.5μl/L浓度作用下弧菌总量第3d下降到最低值，下降总量为65.25%；PHMG在1μl/L浓度下第3d弧菌总量下降到最低值，下降总量为62.29%；PHMG在2μl/L浓度下第3d下降到最低值，下降总量为87.05%。施用一次PHMG，浓度在0.5~2μl/L范围内，第11d池塘水体内弧菌总量仍低于初始值。通过口服专用药物“HPP-1”药饵（剂量6g/kg饲料，连续投喂5d），实验组对虾肝胰腺内可培养弧菌总数直线下降；投喂3d后，各实验组对虾肝胰腺内弧菌总数的杀灭率达99%以上；投喂药饵5d后停药，然后从第6d（停药1d后）开始，各实验组肝胰腺内弧菌总数呈缓慢增长，直到第15d（停药10d后）对虾肝胰腺内的弧菌总数仍然大大低于初始值。
　　对虾养殖收获的统计结果表明：在AHPND的预防实验中，实验组11口土塘、9口小棚，未见AHPND暴发，发病率为0%，最终土塘养殖模式下对虾产量分别为：128kg/亩（规格24只/kg，FCR1.03）和304.5kg/亩（规格54只/kg，FCR1.02）；小棚养殖模式下对虾产量767kg/亩（规格52只/kg，FCR1.06）；对照组中，5口土塘均暴发AHPND，全部死亡后排塘处理；8口小棚其中6口暴发AHPND，发病率75%。
　　在AHPND的治疗实验中，实验组59口土塘、10口小棚、85口高位池、63口室内工厂化养殖池中治愈了53口土塘、10口小棚、60口高位池、63口室内工厂化养殖池，治愈率约86.92%；最终土塘产量109kg/亩~370kg/亩，FCR1.02~1.05；小棚产量567kg/亩，FCR1.08；高位池产量2109.75kg/亩以上，FCR0.97~1.09；室内工厂化产量7.9kg/m2，FCR1.18。未采取治疗措施的对照组均暴发AHPND而排塘处理。
　　多地的预防及治疗中试实验结果表明：采用口服专用药物“HPP-1”和水体消毒剂PHMG相结合的方法能有效定量控制对虾体内和养殖水体中的弧菌总数，该套防控技术方法实用性和可操作性强、预防效果好、治愈率高，为有效防控AHPND、实现对虾健康养殖具有重要的现实意义和应用价值。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1国内外对虾养殖状况

1.2对虾养殖过程中的主要细菌性疾病

1.3对虾细菌性疾病的防控技术研究进展

1.4水产用消毒剂的研究进展和应用

1.5本文研究的目的和意义

第二章 五株急性肝胰腺坏死病潜在致病菌的致病力分析

2.1前言

2.2材料和方法

2.3实验结果

2.4分析与讨论

第三章 几种消毒剂对养殖对虾急性肝胰腺坏死病致病菌的杀灭作用研究

3.1前言

3.2材料和方法

3.3结果

3.4讨论

第四章 候选药物对养殖系统内弧菌的杀灭效果及养殖应用示范

4.1前言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4讨论

全文总结与展望

参考文献

硕士期间完成论文情况

致谢