小反刍兽疫病毒(PPRV)血凝素(H)蛋白的线性B细胞表位作图

摘要

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是一种急性的接触传播的传染病。致病原是小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）。血凝素蛋白（H蛋白）在PPRV侵染过程中负责与宿主细胞的受体结合，能够刺激机体产生保护性免疫。
　　本研究采用改良的生物合成肽法，以抗重组PPRV H蛋白免疫兔血清为一抗，利用Western blot来开展PPRV H蛋白的线性B细胞表位作图研究。本文主要进行了以下研究：
　　1.包含线性B细胞表位16肽片段的筛选
　　首先，设计合成覆盖PPRV H蛋白序列全长的、相互重叠8个氨基酸残基的系列16肽编码DNA序列；在序列的5’端添加BamH I酶切位点序列，在序列的3’端添加TAA-Sal I酶切位点序列；体外退火后连接至 pXXGST-3原核表达载体，得到重组16肽表达载体pXXGST-3-P75-（1~75）。测序验证正确的重组质粒转化BL21感受态细胞，SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗，利用Wester n blot筛选出阳性反应性的16肽片段，从75个GST融合表达的16肽中，获得了14个阳性反应性的16肽，分别为P1、P9、P10、P11、P13、P28、P45、P46、P47、P48、P58、P60、P63和P74。
　　2.阳性16肽最小线性B细胞表位基序鉴定
　　然后，设计合成覆盖各个阳性反应性的16肽序列全长的、相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA序列；在序列的5’端添加BamH I酶切位点序列，在序列的3’端添加TAA-Sal I酶切位点序列；体外退火后连接至pXXGST-3原核表达载体，得到系列重组8肽表达载体。测序验证正确的重组质粒转化BL21感受态细胞，SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗，利用Wester n blot鉴定阳性反应性的16肽的最小表位基序。结果表明除了对应于P13的系列8肽全部为阴性反应，其最小表位基序需要进一步确定外，在对应其它16肽的系列8肽中均筛选到1-6个阳性反应性的8肽。共得到12个最小的线性B细胞表位基序，分别为：8INA10(in P1)，73RLNTNIKL80(in P10)，84IDHQT88(in P11)，224EEGLFGRT231(in P28)，359KDDEANW365(in P45)，367VPSTDV372(in P46)，372VRDLQ376(in P47)，383VEACKTR389(in P48)，463FLGMINT470(in P58)，478VMPHILT484(in P60)，504VDDDIK509(in P63)和590TDEEVHT596(in P74)。
　　3.阳性16肽P13最小线性B细胞表位基序鉴定
　　由于对应于阳性16肽P13蛋白的系列8肽的Wester n blot结果全为阴性，所以我们采用依次缩短肽法鉴定其最小表位基序。设计并合成从N-端和C-端依次减少1-7个氨基酸残基的系列15-9肽编码DNA序列，体外退火并连接至pXXGS T-3原核表达载体，得到系列重组9-15肽表达载体。测序验证正确的重组质粒转化BL21感受态细胞，SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗，利用Wester n blot鉴定P13的最小表位基序。得到一个10肽的最小表位基序：98IIGDEVGIRI107。
　　4.最小线性B细胞表位疫苗免疫羊血清抗体可及性验证
　　以疫苗株PPRV75/1免疫羊血清作为一抗，利用Western blot来验证获得的H蛋白的线性B细胞表位的最小表位基序的抗体可及性。结果表明获得的13个最小B细胞表位基序中，9个具有PPRV疫苗免疫羊血清反应性。
　　5.PPRV H蛋白的线性B细胞最小表位基序的3D建模
　　为了阐述识别的线性B细胞表位的13个最小表位基序在PPRV H蛋白上的空间位置，我们通过Phyre2服务器进行密集建模。预测结果表明，H蛋白头域的412个残基（约占89％）以大于90％的置信度建模。然而，胞尾和茎区没有一个残基的建模置信度大于90％。绘制的线性B细胞最小表位基序分布在预测环、β-折叠和螺旋的区域，并且鉴定的线性B细胞13个最小表位基序中的10个暴露在预测3D结构的表面，表明它们都可能是抗体可接近的线性B细胞表位基序，羊抗体鉴定结果也证明这10个暴露表位中有8个是抗体可及性的表位。其余3个线性B细胞表位基序几乎完全埋在PPRV H蛋白内，其中一个埋藏表位与羊血请抗体有弱阳性反应。

目录

声明

第一章 引 言

1.1 小反刍兽疫与小反刍兽疫病毒概述

1.2 B细胞表位作图研究进展

1.3 本试验的研究意义及主要内容

第二章 PPRV H蛋白线性B细胞表位16肽筛选

2.1 试验材料

2.2试验方法

2.3 试验结果

第三章 PPRV H蛋白线性B细胞表位8肽筛选

3.1阳性16肽表位对应8肽的合成

3.2 试验方法

3.3试验结果

第四章 阳性反应性16肽P13最小表位基序鉴定

4.1 P75-13截短肽（9肽-15肽）的合成

4.2 试验方法

4.3试验结果

第五章 PPRV阳性羊血清验证和3D建模

5.1 试验材料与方法

5.2 试验结果

5.3 3D建模

第六章 全文总结

参考文献

致谢

研究生期间相关科研成果