海洋酸化对海洋青鳉鱼性腺分化的影响

摘要

工业革命之后，来自于化石燃料的燃烧和人类活动的影响，大气中CO2浓度不断增加。其中排放到大气中的24％到35%的CO2被海洋吸收，是引起海水酸度增加和碳酸盐平衡体系改变的主要原因，当前表层海水的pH已经比工业革命时期降低了0.1个单位。到2100年大气CO2的浓度升高至800~1000μL/L（μtam）。科学家们已经意识到过量排放CO2正在改变海洋生物赖以生存的水环境，随着海洋中溶解的CO2日益增多，海水化学环境的改变，生活在广阔无边的海洋中的生物也是深受其害，很可能会对海洋生物生长发育有影响，甚至影响鱼类繁殖后代。因此开展对海水中CO2溶量对鱼类影响研究具有重要意义。
　　海洋青鳉鱼（Oryzias melastigma）隶属于脊索动物门（Chordata）脊椎动物亚门(Vertebrate)辐鳍亚纲鳉形目(Cypernodontiformes)青鳉属(Oryzias)。海水青鳉鱼与日本青鳉鱼的发育上很是接近，当前日本青鳉鱼的解剖和生理方面的研究已经比较完善和系统，这便为海洋青鳉鱼的对应研究提供了便利，同时也使海洋青鳉鱼成为海水生态毒理学研究的模式生物。海洋青鳉鱼个头较小容易在实验室条件下进行大规模饲养。雌雄第二性征明显，性别差异可通过臀鳍的形态不同进行快速的辨别；且雌鱼产卵量大，世代周期短；鱼卵的体积较大，颜色透明且不易破损，发育各阶段变化明显，极易进行各种实验室观察和操作。
　　本文主要研究海洋酸化对青鳉鱼性腺发育及性别分化的影响。首先通过爆CO2模拟海洋酸化水环境处理成年青鳉鱼，观察酸化对其受精率的影响，并通过免疫组化和WB的方法观察酸化对成年青鳉鱼脑部c-fos蛋白的表达区域和表达量的影响。其次研究酸化对受精卵胚胎发育以及性腺发育的影响。最后，我们通过H.E.切片染色观察海洋青鳉鱼性腺发育阶段。
　　对成年海洋青鳉鱼生存环境中通入CO2发现c-fos蛋白在海洋青鳉鱼的大部分脑区，尤其端脑，视顶盖和延脑三个脑区内均能检测到。通入CO2处理和对照组的对比结果，可以初步得出结论，CO2对青鳉鱼脑中的c-fos表达具有一定的影响，使得c-fos的表达水平上调，并在不同的脑区存在差异，由于端脑有接收嗅觉刺激的功能，在通入CO2水中的化学平衡发生改变，免疫图片实验中发现通入CO2后会引起端脑区域的蛋白发生变化，即通入CO2后青鳉鱼的嗅觉能够感受到海水酸碱平衡发生了变化，从而使得在端脑区域有c-fos蛋白的表达；视叶位于间脑后方，是鱼类的视觉中枢，并综合各部分感觉的高级中枢，具有维持鱼体平衡、协调和节制肌肉张力等作用，影响鱼类游泳速度。通入CO2后，观察视顶盖中c-fos蛋白的生成部位和含量变化。发现通入CO2后在视顶盖边缘位置的c-fos蛋白含量比对照组中多，这与现代研究海洋中溶解过多的CO2后降低幼鱼的趋光性的研究相吻合；延脑位于脑的最后部，背面覆盖后脉络丛，其下方为第四脑室，脑室与脊髓内的中央管相同。延脑前部两侧有耳状突，为听囊和侧线的感觉中枢。延脑是多种生理机能以及感觉和呼吸的中枢，还是调节色素细胞作用的中枢。通入CO2后观察到延脑中央有较多的c-fos蛋白表达，较对照组有明显的不同。延脑中出现较多的c-fos蛋白，即青鳉鱼的多种生理机能、感觉或者呼吸中枢等多种活动受到了CO2的影响。本实验中主要是通过观察CO2对海洋青鳉鱼受精的过程研究，观察到受精卵的受精率确实降低，故而推测CO2可能影响了青鳉鱼的产卵和受精的活动，造成受精率发生改变。
　　在青鳉鱼卵发育过程中通入CO2，统计海洋青鳉鱼卵的出膜率，发现海洋青鳉鱼卵的出膜率和孵化时间以及性别比例都会受到酸化的影响，从出膜率的表格中我们能够得到爆CO2浓度为1000ppm时，生存水环境中CO2浓度出现线性趋势，受精率在1000ppm时要比现阶段空气中CO2浓度的受精率要低，但是比通CO2浓度为2000ppm时也要低。同时，在通CO2浓度为1000ppm时，出膜率却远远高于对照组，待其浓度继续增加时，其出膜率反而降低。从而推测：低浓度CO2很可能是作为一种外界刺激，致使孵化中的幼鱼对这个水环境的刺激发生了应激反应；而应激反应促进了青鳉鱼卵孵化出膜速度上升，并且缩短了孵化时间。但是外界环境CO2浓度过高时，对孵化中的幼鱼会是一种危害的信号，致使幼鱼开始自我保护躲避外界的危险信号，延长孵化时间。但是当幼鱼长时间在鱼卵膜内不出膜，往往卵黄中的营养物质消耗殆尽之后仍未出膜，造成由孵化时间过长而出现的死卵情况。
　　将经不同CO2浓度处理的青鳉幼鱼饲养至性成熟后，与未经酸化处理的对照组统计比较其性别比例。通过形态学和分子学水平观察其第二性征和基因性别,发现:
　　1）在体视显微镜下观察，雄性臀鳍要比雌性臀鳍大，背鳍也是雄性相对雌性大。雌性亲鱼的肛乳头要明显大于雄性，并且雌雄肛乳头外周包裹着一层脂肪层，而雄性个体肛乳头外周并未有脂肪层包裹。
　　2）通过分子水平基因检测出：当CO2浓度为1000ppm时，同一批次鱼卵受精产生的个体中有较多的雄性个体，并且有基因型为XX的雌鱼会发生性逆转表现型为雄性的个体，此时逆转率为37%左右；当CO2浓度上升为2000ppm时，有接近47%的性逆转率，此时同一个批次中青鳉鱼有更多的雄性个体。
　　3）对青鳉鱼H.E.切片染色观察对其性腺切片发现海水青鳉鱼的性腺发育要比淡水清鳉鱼的性腺发育的要早，在出膜2天后可以明显观察青鳉鱼原始生殖细胞，一个月龄的青鳉鱼体内已有成熟的精细胞。而淡水清鳉鱼在出膜后第五天内观察到原始生殖细胞，一月龄体内无成熟的生殖细胞。
　　我们对海水青鳉鱼在通CO2后引起海洋酸化的环境中生长和发育的进行了初步探索，推测出CO2可作为影响海水青鳉鱼性腺分化发育过程中一个重要因素。

目录

声明

第一章 引言

1.1 海洋酸化现状

1.2海洋酸化对海洋鱼类的影响

1.3海水青鳉鱼生物学特征和饲养管理

1.4鱼类性别决定基因及其研究进展

1.5温度影响性别的研究进展

1.6海水青鳉鱼性别决定基因的研究现状

1.7 c-fos 蛋白

1.8本研究的目的及意义

第二章 海洋酸化对青鳉鱼脑部c-fos表达和成鱼受精率的影响

2.1材料与方法

2.2方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第三章 海水酸化对青鳉鱼卵发育的影响

3.1材料试剂

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 海水酸化对青鳉鱼性别发育的影响

4.1材料与方法

4.2引物设计

4.3实验步骤

4.4结果与分析

4.5讨论

第五章 海水青鳉鱼性腺发育过程

5.1材料与方法

5.3结果

5.4讨论与分析

小结与展望

参考文献

致谢