类胡萝卜素含量和SCD基因表达水平对合浦珠母贝高温适应性的影响

摘要

合浦珠母贝（Pinctada fucata）是我国重要的海水经济珍珠贝类，主要分布在我国的广东、广西、海南等地。然而由于近年来海区夏季水温不断升高，合浦珠母贝的生长存活受到了严重的影响。本研究为了探讨类胡萝卜素及其相关基因在合浦珠母贝耐高温方面的作用，开展了高温胁迫下不同类胡萝卜素含量的合浦珠母贝体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以及总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）和总类胡萝卜素含量（Total carotenoids content，TCC）变化的研究，还通过分子生物学技术克隆获得了合浦珠母贝PfSCD基因cDNA全长，并研究了该基因在高温胁迫下合浦珠母贝中的组织差异性表达及其与总类胡萝卜素含量、总抗氧化能力的关联性分析研究，初步证实类胡萝卜素在合浦珠母贝中耐高温进程中发挥着积极作用，为合浦珠母贝耐高温品系的选育提供了新的方向。主要结果如下：
　　1.不同类胡萝卜素含量的合浦珠母贝对高温胁迫的免疫响应
　　不同类胡萝卜素含量的合浦珠母贝对高温胁迫的免疫响应研究表明，合浦珠母贝成活率随温度升高（26-34℃）和总类胡萝卜素含量的降低而显著降低（P＜0.05）；总类胡萝卜素含量越高其成活率也就越高。总类胡萝卜素含量和总抗氧化能力均随胁迫时间的增加而降低（34℃）。相关性分析表明，总抗氧化能力与总类胡萝卜素含量呈显著线性正相关（P＜0.01），成活率与总类胡萝卜素含量和总量氧化能力均呈显著S型相关（P＜0.01）。免疫响应分析显示总类胡萝卜素含量高的家系的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性以及丙二醛含量均显著低于总类胡萝卜素含量低的家系（P＜0.05），而且胁迫时间从0-96 h的变化范围内，以上指标的变化显著（P＜0.05）而且各个家系合浦珠母贝中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性以及丙二醛含量均在0-3 h内升高，3-24 h内降低，24-96 h再升高，并于24 h处达到最低即总类胡萝卜素含量越高其超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性以及丙二醛含量就越低。上述研究说明，高温胁迫下，合浦珠母贝体内的类胡萝卜素是机体的抗氧化系统的重要组成部分，对增强机体抗逆性方面发挥着一定积极作用，可作为抗逆品系选育的指标。
　　2.合浦珠母贝硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）基因的克隆、序列特征、进化分析及其不同发育时期和组织的表达谱
　　利用基因克隆技术获得了合浦珠母贝的SCD基因并命名为PfSCD（Gene Bank登录号：KY849348），其cDNA全长为1576 bp，包含一个945 bp的开放阅读框（Open reading frame, ORF）以及两个非编码区（Untranslated Regions，UTR）分别为：442 bp的3’-UTR和189 bp的5’-UTR。开放阅读框编码315个氨基酸，包含4个跨膜结构域（Transmembrane domains，TMs）、3个组氨酸模体（Histidine-box motifs，HMs）与其他物种的多重比对显示具有高度同源性。此外还发现该序列具有5个功能结构域，其中3个为与脂肪酸相关结构域，包括1个脂肪酸羟化酶家族（Fatty acid hydroxylase superfamily，FA_hydroxylase）成员（36-122 aa）和2个脂肪酸去饱和酶家族（Fatty acid desaturase，FAD）成员（61-301 aa，254-268 aa）。另外2个分别是位于195-215 aa的核算定位本地化（Bipartite nuclear localization signal profile，NLS_BP）结构域和296-310 aa的未知功能（Protein of unknown function，DUF321）结构域。进化分析结果显示合浦珠母贝PfSCD与太平洋牡蛎SCD首先聚为一支，然后再与其他软体动物聚为一支，表明合浦珠母贝的PfSCD与太平洋牡蛎SCD等软体动物的同源性较高，与其他物种的同源性较低。实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）检测结果表明PfSCD mRNA在合浦珠母贝的发育时期和组织中具有显著差异，在变态幼虫期、肝胰腺和担轮幼虫期、足中分别检测到最大和最小值。
　　3.合浦珠母贝PfSCD mRNA组织差异性表达及其与总类胡萝卜素含量（TCC）和总抗氧化能力（TAC）的相关性分析
　　在高温胁迫下和未胁迫下不同类胡萝卜素含量的合浦珠母贝中PfSCD mRNA的实时表达量均具有组织差异性，且该基因在实验组（橘色组）和对照组（白色组）的肝胰腺、性腺以及闭壳肌足中表达量显著高于外套膜、鳃和足（P＜0.05）。且同一胁迫时间下，相同组织的实验组PfSCD mRNA的实时表达量显著高于对照组（P＜0.01）。在0-96 h的胁迫时间内，实验组和对照组PfSCD mRNA的实时表达量均随着胁迫时间增加呈先上升后下降的趋势。不同的是实验组在12 h胁迫后PfSCD mRNA表达量达到最大值而对照组则是3 h胁迫后达到最大值。此外高温胁迫下实验组和对照组不同组织中TAC和TCC随胁迫时间的结果显示，实验组和对照组的肝胰腺、性腺以及闭壳肌组织中TAC和TCC均随胁迫时间的增加呈马蹄形的变化趋势，即先下降后上升再下降，而其他组织如外套膜、鳃和足则不断降低。同一胁迫时间下相同组织实验组的PfSCD mRNA的相对表达量显著高于对照组（P＜0.01）。高温胁迫下合浦珠母贝的TAC与TCC的相关性分析表明，它们之间具有显著的线性正相关。综上所述，类胡萝卜素在合浦珠母贝的耐高温过程中发挥着积极的作用，为合浦珠母贝抗逆性新品种的选育提供了新的方向。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

1.1贝类体内类胡萝卜素类的研究进展

1.2 SCD 基因的研究进展

1.3 研究内容及目的意义

第二章 不同类胡萝卜素含量的合浦珠母贝对高温胁迫的免疫响应

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 合浦珠母贝SCD 基因的克隆、结构特征、进化分析及其发育时期和组织表达谱

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

第四章 合浦珠母贝PfSCD 基因的组织差异性表达及其与总类胡萝卜素含量（TCC）和总抗氧化能力（TAC）的相关性分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录1缩略词表

附录2硕士在读期间学术成果

致谢