c-Abl与泛素类似蛋白hPLIC-2的相互作用

摘要

人的泛素类似蛋白hPLIC-2是酵母Dsk2和鼠PLICs(proteins link IAP and cytoskeleton,PLICs)的同源类似物,作为蛋白酶体底物载体发挥作用,并可能在蛋白酶体及泛素化的酶系之间建立功能联系.该研究通过体内、体外相互作用研究,表明hPLIC-2可与c-Abl直接相互作用,hPLIC-2 C端的UBA是hPLIC-2与c-Abl相互作用的重要结构域.而c-Abl通过其N端片段与hPLIC-2相互作用,调节hPLIC-2参与的蛋白质经泛素-蛋白酶体降解.体内蛋白酪氨酸磷酸化分析和体外激酶分析表明,c-Abl不能磷酸化hPLIC-2,因此c-Abl以激酶非依赖方式与hPLIC-2相互作用并调节蛋白质降解.即这种作用仅依赖于c-Abl或Arg蛋白的存在,而与其激酶活性无关.该研究发现,细胞内的反应氧可以促进c-Abl与hPLIC-2的相互作用,可能与c-Abl在氧化应激反应中促进蛋白质降解相关;c-Abl和hPLIC-2过量表达导致细胞内总蛋白泛素化水平升高;有趣的事,抑制hPLIC-2的表达也可促进细胞内蛋白质的泛素化.c-Abl可促进hPLIC-2与蛋白酶体亚基结合,从而可能促进hPLIC-2所结合泛素化蛋白的降解;c-Abl促进hPLIC-2与泛素化蛋白结合,促进hPLIC-2在细胞内收集泛素化底物.综上所述,c-Abl通过与hPLIC-2的相互作用可能是调控蛋白质经泛素-蛋白酶体降解的新机理.

目录

文摘

英文文摘

致谢

缩略词表

前言

材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株和细胞

1.1.2分子生物学工具酶及其它产品

1.1.3基因

1.1.4引物合成及测序

1.1.5细胞培养用品

1.1.6蛋白质纯化、免疫共沉淀试剂、免疫试剂

1.1.7其它试剂

1.1.8主要仪器设备

1.1.9实验动物

1.1.10放射性同位素

1.2实验方法

1.2.1 PCR扩增

1.2.2目的基因真核表达载体和原核表达载体的构建

1.2.3 DNA纯化和质粒提取

1.2.4 GST融合蛋白在大肠杆菌JM109中的诱导表达和纯化

1.2.5兔抗hPLIC-2多克隆抗体的制备

1.2.6细胞培养和细胞转染

1.2.7免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)

1.2.8 GST融合蛋白体外相互作用实验

1.2.9免疫印迹(imunnity blot，IB；Western Blot,WB)

1.2.10体外直接相互作用研究(Far-Westin blot)

1.2.11蛋白质浓度的测定

1.2.12 SiRNA(hPLIC-2)稳定表达细胞的建立

1.2.13 GFP和RFP融合蛋白表达的观察

1.2.14酪氨酸磷酸化体外激酶分析

结果

2.1抗hPLIC-2多克隆抗体的制备

2.1.1 GST-hPLIC-2的表达与纯化

2.1.2 hPLIC-2多克隆抗体的制备和鉴定

2.2 SiRNA抑制hPLIC-2表达的稳定细胞的建立

2.3 c-Abl与hPLIC-2相互作用的研究

2.3.1 c-Abl与hPLIC-2在细胞内形成复合体

2.3.2 c-Abl与hPLIC-2载体外直接相互作用

2.3.3 hPLIC-2与c-Abl相互作用的结构域

2.3.4氧化应激促进c-Abl与hPLIC-2之间的相互作用

2.3.5 Arg与hPLIC-2相互作用

2.4 c-Abl促进hPLIC-2与蛋白酶体亚基的结合

2.5 c-Abl与hPLIC-2相互作用对蛋白质泛素化的影响

2.5.1 hPLIC-2与泛素化蛋白结合研究

2.5.2 c-Abl与hPLIC-2影响细胞内总蛋白质泛素化水平

2.5.3 c-Abl影响hPLIC-2与泛素化蛋白的结合

2.6 c-Abl对hPLIC-2酪氨酸磷酸化作用研究

讨论

3.1兔抗hPLIC-2多克隆抗体的制备

3.2 hPLIC-2表达抑制细胞系的建立

3.3 hPLIC-2与c-Abl的相互作用

3.4 c-Abl通过hPLIC-2调节泛素化蛋白降解

总结与展望

参考文献

综述1

综述2

附录1

附录2