hPL1C-2在泛素—蛋白酶体途径中的功能及与c-Abl的相互作用

摘要

人泛素类似蛋白hPLIC-2是酵母Dsk2和鼠PLICs(proteinslinkIAPandcytoskeleton，PLICs)的同源类似物。在结构上具有两个重要的结构域，即N端的泛素类似结构域(UBL)和C端的泛素结合结构域(UBA)。hPLIC-2过表达时可特异性干扰依赖泛素的蛋白的降解，还可与蛋白酶体和E3泛素连接酶相互作用，在泛素化酶系和蛋白酶体间建立功能联系，但其在泛素蛋白酶体途径的具体功能未知。酵母双杂交实验发现：hPLIC-2可与c-Abl(cellular-Abelsongene)，即Abelson鼠白血病病毒(murineleukemiavirus)v-abl原癌基因在细胞内的同源基因，直接相互作用，而c-Abl可抑制蛋白酶体的降解活性。为此，本实验旨在研究hPLIC-2在泛素蛋白酶体途径中的调控及与c-Abl的相互作用。 本研究采用RNA干扰技术，利用逆转录病毒载体和MCF-7细胞，结合细胞培养与转染、克隆筛选与免疫印迹实验，建立了稳定抑制内源性的hPLIC-2表达的细胞系；构建了pGEX-2T-hPLIC-2原核表达载体，制备了GST-hPLIC-2融合蛋白，融合蛋白与佛氏完全佐剂共同免疫新西兰大白兔，所得抗血清经纯化后制成了高滴度特异性的抗hPLIC-2多克隆抗体。以上实验为进一步研究hPLIC-2的功能打下基础。进一步的免疫印迹、免疫沉淀实验证明，hPLIC-2可促进细胞内总蛋白的泛素化；当hPLIC-2表达被抑制时(转染siRNA(hPLIC-2)质粒的DKO细胞和抑制细胞系中)，细胞内总蛋白的泛素化水平明显降低；而hPLIC-2和c-Abl共同转染DKO细胞，细胞内总蛋白的泛素化水平又比单独转染hPLIC-2得到了更大程度的提高，提示hPLIC-2和c-Abl可能协同作用提高细胞总蛋白泛素化水平。采用同位素示踪技术检测hPLIC-2和c-Abl对细胞内总蛋白降解的调控时发现，hPLIC-2可抑制细胞内总蛋白的降解；而当hPLIC-2表达被抑制(转染siRNA(hPLIC-2)质粒的DKO细胞和抑制细胞系中)时，细胞内总蛋白的降解量显著升高；hPLIC-2和c-Abl共同转染DKO细胞时，细胞内总蛋白的降解比单独转染hPLIC-2时受到了更大程度的抑制；提示hPLIC-2和c-Abl协同作用抑制总蛋白质的降解。与此同时，为了确保结果的可靠性，我们转染了表达绿色荧光蛋白的pEGPF-C1质粒，采用流式细胞仪测定转染效率达92.8％，在进行数据处理时扣除了非转染细胞对实验结果的影响。由此推测，hPLIC-2与c-Abl协同作用抑制细胞内总蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解而导致细胞内泛素化蛋白的积累。 本研究首次利用RNA干扰技术，从细胞内总蛋白的泛素化水平和降解调控的角度阐述了hPLIC-2与c-Abl调控蛋白质经泛素-蛋白酶体途径降解的可能机制，对深入认识泛素类似蛋白家族在正常细胞中的功能具有重要的理论意义。

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一章泛素-蛋白酶体途径与hPLIC-2的研究背景

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附录

缩略词表

致谢

作者简介