草鱼TGF-β1、Smad4基因真核过表达和RNA干扰表达载体的构建及其活性验证

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是目前全球最大的淡水养殖品种，仅在国内年产量就4百余万吨，它不仅是世界上发达地区和欠发达地区廉价蛋白的主要来源，同时也为优质动物蛋白的供应做出了巨大贡献［1］。关于草鱼营养学研究也早已开始，针对目前的研究现状我们也做了一些营养调控机理方面的探索，先前有学者在研究工作中发现摄食蚕豆的草鱼肌肉硬度显著增加而深受消费者欢迎［2］；有研究显示鱼类肌肉硬度的增加与Ⅰ型胶原蛋白的表达有显著相关性［3］，而Ⅰ型胶原蛋白的表达受TGF-β1/Smad4信号通路调控［4］；为了探究草鱼肌肉品质改良的营养调控机制，本文主要构建了草鱼TGF-β1/Smad4信号通路关键信号因子TGF-β1和Smad4基因的真核过表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1和pcDNA3.1(+)-Smad4和RNA干扰表达载体pRNA-6.1/Neo-TGF-β1（Ⅰ）、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅱ)、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅰ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅲ)，随后分别在细胞和鱼体水平验证构建的过表达和RNA干扰表达载体的活性，企图为后续研究奠定坚实的理论基础，现将本文主要实验内容概括如下：
　　1、本文首先克隆了草鱼TGF-β1、Smad4基因开放阅读框（ORF，Open Reading Frame）序列各1134 bp、1644 bp。其次，在TGF-β1、Smad4序列两端分别加上相应的酶切位点，同时对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切，将带酶切位点的片段正向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建TGF-β1、Smad4基因的真核过表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1、pcDNA3.1(+)-Smad4.另一方面，根据TGF-β1、Smad4基因序列全长分别设计3对长度为48 bp的shRNA，然后将构建好的shRNA插入到载体pRNA-U6.1/Neo中，即成功构建TGF-β1、Smad4基因的RNA干扰表达载体pRNA-6.1/Neo-TGF-β1（Ⅰ）、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅱ)、pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅰ)、pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅲ)。本文构建成功的草鱼TGF-β1、Smad4基因的RNA干扰表达载体和真核过表达载体，可为下一步草鱼肌肉发育过程中TGF-β1/smad4信号通路作用的研究奠定基础。
　　2、为在细胞水平上进一步检测构建的过表达和RNA干扰表达载体的有效性，本文首先进行了草鱼成纤维细胞的分离和原代培养，因分离后的草鱼成纤维细胞未能形成稳定细胞系，随后将过表达载体和干扰载体转染至稳定的斑马鱼 ZF4细胞系；因转染效果不佳，后期针对不同物种做了相关的生物信息学分析（包括蛋白结构域和氨基酸序列同源性比对），同源性比对结果显示人与草鱼蛋白序列同源性高达百分之九十以上；随后将过表达载体和RNA干扰表达载体转染至293T细胞做进一步验证实验，转染36h（转染效率可达80％）后荧光定量检测TGF-β1、Smad4和Ⅰ型胶原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）基因的相对表达量；结果显示，过表达实验组草鱼TGF-β1、Smad4及Ⅰ型胶原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）基因的表达量显著高于对照组（P＜0.05），对人TGF-β1、Smad4和Ⅰ型胶原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）基因的检测结果显示无显著差异；RNA干扰实验组相比于对照组Ⅰ型胶原蛋白（COL1-A1和COL1-A2）及TGF-β1、Smad4基因的表达量较对照组显著降低（ P＜0.05）且鉴定出 pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)的干扰效果最好.本实验已在细胞水平上很好的验证了表达载体的有效性。
　　3、本文在鱼体水平又进一步的检测了TGF-β1、Smad4基因过表达和RNA干扰表达载体的活性，结果显示过表达实验组36h和48h目的基因相对表达量显著高于对照组；RNA干扰表达载体 pRNA-6.1/Neo-TGF-β1(Ⅲ)和pRNA-6.1/Neo-Smad4(Ⅱ)36h均有一定的干扰效果但效果不显著,48h表达量急剧上升，鱼体水平的结果也说明了过表达载体的活性很高，RNA干扰表达载体有一定活性但活性较低；本实验在鱼体水平也较好的验证了TGF-β1和Smad4基因过表达载体和RNA干扰表达载体的活性。
　　本实验所进行的TGF-β1和Smad4基因过表达和RNA干扰表达载体的构建及其活性验证，不仅可为后期从营养学的角度进一步探究草鱼肌肉发育的营养调控机制奠定理论基础，也将为其他鱼类研究提供参考和借鉴。

目录

声明

引言

第一章 TGF-β/smads信号通路研究概述

1 TGF-β/smads信号通路概述

2 TGF-β/smads信号通路调控鱼类生长发育

3 TGF-β1/smad4信号通路参与调节Ⅰ型胶原蛋白的表达

4 研究的目的意义和主要内容

第二章 草鱼TGF-β1、Smad4基因克隆及真核过表达和RNA干扰表达载体的构建

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 过表达和RNA干扰表达载体细胞水平活性检测

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4讨论和总结

第四章 过表达和RNA干扰表达载体鱼体活性检测

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4 讨论与总结

全文总结与展望

参考文献

附录 硕士期间论文发表情况

致谢