Wnt及相关基因在厚壳贻贝幼虫生长发育过程中的作用

摘要

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）是中国沿海重要的经济贝类之一，其幼虫附着变态的成功与否直接决定育苗的成败。探究厚壳贻贝幼虫附着变态有关的基因对厚壳贻贝的养殖有着重要的意义。在过去的研究发现Wnt信号通路相关的基因可以调控海洋无脊椎幼虫的生长发育和附着变态，Wnt信号通路分为经典信号通路和非经典信号通路，两种信号通路在同一物种中有着不同的功能，因此本文从转录组数据中筛选出4个Wnt信号通路相关基因，并通过RACE技术和荧光定量技术探究其在厚壳贻贝幼虫生长发育和附着变态过程中的作用。主要包括以下内容：
　　1.厚壳贻贝Wnt4基因的克隆和表达分析
　　为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用，通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因cDNA全长序列，该序列全长3342 bp，开放阅读框为1074 bp，编码357个氨基酸。通过RT-PCR分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体7个组织中均有表达，其中在外套膜中表达量最高，推测可能与贝壳形成有关；Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期，并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。
　　2.厚壳贻贝Wnt7b基因的克隆和表达分析
　　为研究 Wnt7b基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和成体各个组织生长过程中的作用，利用RACE技术得到了厚壳贻贝Wnt7b基因cDNA全长序列，该序列全长1910 bp，开放阅读框为1059 bp，编码352个氨基酸。通过RT-PCR分析发现Wnt7b基因在厚壳贻贝成体的7个组织中都有表达，其中在鳃和雌雄性腺中表达量最高，推测Wnt7b基因可能与厚壳贻贝性腺的成熟有关；Wnt7b基因在厚壳贻贝5个发育阶段都有被检测到，其中在D形幼虫中表达量最高，从D形幼虫到眼点幼虫这个过程中表达量逐渐降低。推测该基因在厚壳贻贝的幼虫生长发育和变态中有非常重要的作用。对该基因的相关功能和调控机制还需深入研究，为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究奠定了提供了理论依据。
　　3.厚壳贻贝Wnt6基因的克隆和表达分析
　　为研究Wnt6基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和成体各个组织生长过程中的作用，利用RACE技术克隆得到了厚壳贻贝Wnt6基因cDNA全长序列，该序列全长1616bp，开放阅读框为1032 bp，编码343个氨基酸。通过RT-PCR分析发现Wnt6基因在厚壳贻贝成体的7个组织中的表达情况，发现在鳃、外套膜、足、雌性性腺和雄性性腺有表达，而在消化腺和闭壳肌中不表达。其中在外套膜中的表达量最高，推测可能与贝壳形成相关；Wnt6基因在厚壳贻贝幼虫5个发育阶段表达发现仅在壳顶幼虫和稚贝中有表达，而在眼点幼虫阶段并不表达，表明Wnt6可能参与了幼虫的附着变态发育过程，且可能参与了幼虫的生理、贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。综上所述，Wnt6可能在厚壳贻贝幼虫附着变态发育过程中发挥负反馈调控作用，对该基因的相关功能和调控机制还需进一步的实验验证。本研究为进一步开展Wnt基因家族在双壳贝类附着变态发育的功能方面研究提供了理论依据。
　　4.厚壳贻贝β-catenin基因的克隆和表达分析
　　为探究β-catenin基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用，并且探究其与Wnt信号通路的关系，利用RACE技术克隆得到了厚壳贻贝β-catenin基因cDNA全长序列，该序列全长4051 bp，开放阅读框为2490 bp，编码829个氨基酸。通过RT-PCR分析发现β-catenin基因在厚壳贻贝成体的7个组织中都有表达，其中在消化腺和鳃中的表达量最高，推测β-catenin基因可能与厚壳贻贝的摄食有关；β-catenin基因在厚壳贻贝5个发育阶段都有被检测到，在稚贝和壳顶幼虫中表达量最高，在眼点幼虫阶段表达量最低，表明β-catenin可能参与了幼虫的附着变态发育过程，并且在厚壳贻贝幼虫的附着变态发育过程中发挥负反馈调控作用。通过和前面研究相比较发现，β-catenin和Wnt6在厚壳贻贝幼虫附着变态发育过程中发挥负反馈调控作用，证明在厚壳贻贝经典Wnt通路中，Wnt信号分子与膜蛋白结合，使β-catenin大量聚集，进入细胞核中，激活Wnt信号通路中的下游信号分子来调控厚壳贻贝幼虫的附着变态。由于经典Wnt信号通路是由许多分子组成，因此，在厚壳贻贝幼虫附着变态的过程中这些分子如何协调参与这一生理过程，尚需进一步地进行研究。
　　综上所述，经典Wnt信号通路中的Wnt6和Wnt7b基因可能参与调控厚壳贻贝幼虫的附着变态，而非经典Wnt信号通路中的Wnt4基因可能不参与调控厚壳贻贝幼虫的附着变态。β-catenin基因可能也参与调控厚壳贻贝幼虫的附着变态，证明了Wnt信号分子可能是通过β-catenin基因传递给下游信号分子来调控厚壳贻贝幼虫的附着变态。

目录

声明

引言

第一章 Wnt基因在海洋无脊椎动物幼虫生长发育过程中的作用研究进展

1 Wnt基因

2 Wnt基因在脊椎动物生长发育中的研究进展

3 Wnt基因在海洋无脊椎动物幼虫的生长发育过程中的研究

4 展望

第二章 厚壳贻贝Wnt4基因的克隆和表达分析

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 厚壳贻贝Wnt7b基因的克隆和表达分析

3.1 材料和方法

3.2结果

3.3 讨论

第四章 厚壳贻贝Wnt6基因的克隆和表达分析

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 厚壳贻贝β-catenin基因的克隆和表达分析

5.1 材料和方法

5.2 结果

5.3 讨论

小结

参考文献

附录

致谢