虎杖中α—葡萄糖苷酶抑制成分的分离提取及性质研究

摘要

本文采用生物活性(α-葡萄糖苷酶活性)指导下的导向分离技术从中药虎杖中分离和纯化了具有显著α-葡萄糖苷酶抑制活性的两种物质-A和B。首次确认这两种成分对α-葡萄糖苷酶和醛糖还原酶都具有强烈的抑制活性。动物实验显示：两种物质均能明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖及正常小鼠的餐后血糖。本文侧重探讨了活性组分的筛选、分离提取和纯化工艺以及两种组分的化学、酶学性质及体内降血糖活性。 活性物质分离提取和纯化的主要工艺路线：乙醇浸提→石油醚脱脂→乙酸乙酯萃取→硅胶柱层析→浓缩干燥。得到HPLC纯度分别为96.3％和99％以上的两种组分，经红外、质谱、核磁共振及相关化学方法定性分析，初步确定分别为大黄素类物质(下文简称A)和二苯乙烯类物质(下文简称B)。酶促反应动力学实验表明：物质A对α-葡萄糖苷酶为竞争性抑制，比活性为298U/mg，Km=0.179mmol/L，Ki=3.09μg/mL；物质B对α-葡萄糖苷酶为非竞争性抑制，比活性为408U/mg，Km=0.182mmol/L，Ki=2.78μg/mL。动物实验表明，每天按200mg/kg小鼠给药，连续给药八天，物质A和物质B对四氧嘧啶糖尿病小鼠均有明显的降血糖作用，其中物质B的降血糖效果要优于物质A，接近市售格华止和拜糖苹的降糖效果。按300mg/kg给药的小鼠餐后血糖实验中两种物质均显示出较好的降餐后血糖作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章综述

1糖尿病及其并发症

1.1糖尿病的发病机理

1.2糖尿病并发症的发病机理

1.3糖尿病的药物治疗

1.4糖尿病并发症的药物治疗

1.5中药治疗糖尿病的现状和研究进展

2与糖代谢有关的几种酶及其抑制剂

2.1 α-葡萄糖苷酶及其抑制剂

2.2己糖激酶(Hexoki nase,HK)

2.3醛糖还原酶及其抑制剂

3虎杖的化学成分及药理作用

3.1虎杖的化学成分

3.2虎杖的药理作用

4研究内容、目的和意义

第二章试剂与仪器

1材料

2试剂

2.1 α-葡萄糖苷酶酶活力测定试剂配制

2.2己糖激酶酶活力测定试剂配制

2.3醛糖还原酶提取和活力测定试剂配制

2.4葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力测定试剂配制

2.5化学成分分析试剂

2.6薄层层析用试剂

2.7柱层析用试剂

2.8动物实验用试剂

3仪器与设备

4实验用动物

第三章实验方法

1酶活力的测定

1.1 α-葡萄糖苷酶及抑制剂活力的测定

1.2己糖激酶及其激活剂的活力测定

1.3醛糖还原酶的提取及其抑制剂活力的测定

2虎杖中有效成分的提取分离

2.1虎杖有效成分的分离提取

2.2虎杖有效成分的纯化

3提取物化学成分预试验

3.1检测氨基酸

3.2检测酚类

3.3检测糖类

3.4检测皂甙

3.5检测黄酮类

3.6检测生物碱类

3.7检测蒽醌类

3.8检测二苯乙烯类

4活性物质的纯度测定

4.1薄层层析

4.2 HPLC分析

5活性物质的波谱分析

6活性物质的酶学性质

6.1活性物质对温度的稳定性试验

6.2活性物质对pH的稳定性试验

6.3活性物质与α-葡萄糖苷酶作用时间对酶活的影响

6.4不同量活性物质对酶活性的影响

6.5活性物质酶促反应动力学试验

7活性物质对小鼠的降血糖作用

7.1小鼠的饲养

7.2餐后血糖实验

7.3连续给药实验

7.4取血用离心管的准备

7.5取血方法

7.6分离血浆

7.7测定血糖

第四章实验结果与讨论

1虎杖有效成分的分离纯化及糖苷酶抑制活性变化

2物质A和物质B化学成分预试验

3物质A和物质B的纯度测定

3.1硅胶板检测

3.2 HPLC检测

4结构鉴定

4.1物质A的结构分析

4.2物质B的结构分析

4.3物质A和物质B的红外光谱、质谱、和核磁共振图谱

5物质A和物质B的酶学性质

5.1物质A的酶学性质

5.2物质B的酶学性质

6物质A和物质B对醛糖还原酶及己糖激酶的影响

7物质A及物质B的体内降血糖活性

7.1小鼠餐后血糖试验

7.2连续给药对四氧喀啶小鼠的降血糖作用

8讨论

8.1活性成分的分离提取

8.2活性成分的定性分析

8.3提取物的理化及酶学性质

8.4有关动物实验

第五章结论与展望

1结论

2展望

参考文献

致谢

附录一：PNP标准曲线

附录二：物质A及物质B有关波谱图