盐藻功能基因组学研究——研究资源的构建及重要基因的分离和鉴定

摘要

盐藻是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，能在含0.05-5.5 mol/L NaCl的培养液中生存，是迄今发现的最耐盐的真核生物之一。极强的耐盐能力及简单的细胞结构使盐藻成为研究植物适应盐胁迫的分子机制的重要模式生物。同时，开发和利用盐藻的耐盐基因资源对于提高农作物的抗盐能力也具有重要意义。 为了深入开展盐藻功能基因组学研究，本文首先系统地构建了盐藻(Dunaliella viridis)基因组细菌人工染色体文库、全长均一化cDNA文库及酵母表达文库。 盐藻基因组文库是克隆完整耐盐基因、研究耐盐机理的重要研究资源。而构建大插入片断基因组文库，则可以更容易地分离到目的基因的全长DNA序列及调控元件。以pCC1BAC为载体，构建了盐藻(Dunaliella viridis)基因组细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共有9216个转化子，插入片段平均长度为55 Kb，约覆盖4倍盐藻基因组。同时建立了该文库的四维。PCR基因筛选体系，可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆。该文库的构建和筛选方法的建立，为克隆盐藻耐盐基因及对其进行基因组学研究创造了有利条件。 cDNA文库是获得功能基因序列的基本手段，是发现新基因和研究基因功能的基本工具。而全长cDNA文库可以在单个克隆中获得对应基因转录本的完整序列信息；均一化则可以有效地降低cDNA文库中高丰度转录本的冗余，提高基因筛选和EST测序的效率。我们结合了SMART技术和cDNA均一化技术，构建了盐藻的全长均一化cDNA文库。该文库共含有约1.2×10<'6>个克隆，重组率大于98％，平均插入片段长度约为0.9 Kb。该文库的构建为盐藻基因全长cDNA的克隆及进行大规模EST测序分析奠定了基础。 通过酵母遗传互补系统分离基因是一种高效的基因分离方法。我们采用Stratagene公司的cDNA合成方案，采用酵母表达载体pAJ401和pYES2，构建了两个盐藻cDNA酵母表达文库。两个文库的容量分别为5.6×10<'5>和5.2×10<'5>，重组率均大于95％，平均插入片段长度约为1.3 Kb。盐藻cDNA酵母表达文库的构建，为利用酵母系统筛选和克隆相应的盐藻耐盐相关基因提供了必要条件。 然后，利用上述构建的功能基因组学研究资源，我们对盐藻中的几个重要基因进行了分离和鉴定。首先根据本实验室从盐藻中分离的两个盐诱导型碳酸酐酶基因(DvCA1和DvCA2)的cDNA序列，通过PCR方法从盐藻基因组BAC文库中分离了DvCA1和DvCA2的BAC克隆，并分别构建了鸟枪测序文库，为获得两个碳酸酐酶的全长基因及盐诱导型启动子、进一步研究基因的结构与功能及表达调控机理打下了基础。 其次，根据本实验室获得的盐藻耐盐相关基因-△9-脂肪酸去饱和酶基因(DvFAD1)的EST序列，通过SMART 5'-RACE方法从盐藻全长均一化cDNA文库中克隆了DvFAD1的全长cDNA编码序列。序列分析表明，该cDNA序列长1601 bp，包含一个1257 bp的开放阅读框，编码一段419个氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明，它与高等植物的△9-脂肪酸去饱和酶同源性较高，而与酵母的序列同源性较差。该序列的获得为进一步研究.DvFAD1的功能及利用该基因改良植物抗逆性创造了有利条件。 最后，还通过酵母功能互补系统对本实验室分离到的另一盐藻耐盐相关基因-海藻糖-6-磷酸合成酶基因(DvTPS)进行了功能鉴定，发现该基因可以部分互补G19的盐敏感表型，表明DvTPS具有一定的抗盐功能。同时，我们还克隆了拟南芥中rd29A及rd29B基因的逆境诱导型启动子(Prd29A及Prd29B)，并以pBI121为骨架构建了分别由组成型的CaMV 35S启动子、逆境诱导型的Prd29A及Prd29B调控的DvTPS的植物表达载体，为利用DvTPS改良植物抗逆性打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述—盐藻耐盐机制研究进展

1 盐藻简介

2 盐藻耐盐机制研究进展

2.1 渗透调节

2.2 离子平衡与营养吸收

2.3 质膜组分

2.4 光合作用

2.5 信号传导

2.6 小结

参考文献

第二章盐藻功能基因组学研究资源的构建

1 引言

2 材料

2.1 生物材料、载体及菌株

2.2 主要试剂

2.3 PCR引物

3 方法

3.1 盐藻的培养

3.2 盐藻基因组BAC文库的构建和鉴定

3.3 盐藻全长均一化cDNA文库的构建

3.4 盐藻cDNA酵母表达文库的构建

4 结果与分析

4.1 盐藻基因组BAC文库的构建和鉴定

4.2 盐藻全长均一化cDNA文库的构建

4.3 盐藻cDNA酵母表达文库的构建

5 讨论

5.1 盐藻基因组BAC文库的构建和鉴定

5.2 盐藻全长均一化cDNA文库的构建

5.3 盐藻cDNA酵母表达文库的构建

参考文献

第三章盐藻重要基因的分离与鉴定

1 引言

2 材料

2.1 生物材料、菌株及质粒

2.2 主要试剂

2.3 PCR引物

3 方法

3.1 DvCA1及DvCA2 BAC克隆的筛选

3.2 DvCA1及DvCA2 BAC克隆的鸟枪测序文库的构建

3.3 DvFAD1的5'-RACE扩增

3.4 DvFAD1 5'-RACE产物的克隆、测序及分析

3.5 DvTPS酵母转化载体的构建、酵母转化及功能分析

3.6 rd29A及rd29B基因启动子的分离、克隆及测序

3.7 DvTPS植物转化载体的构建

4 结果与分析

4.1 DvCA1及DvCA2 BAC克隆筛选

4.2 DvCA1及DvCA2 BAC克隆的鸟枪测序文库的构建

4.3 DvFAD1的5'-RACE扩增

4.4 DvFAD1的序列分析

4.5 DvTPS在酵母中的功能鉴定

4.6 DvTPS植物转化载体的构建

5 讨论

5.1 DvCA1及DvCA2 BAC克隆的筛选及其鸟枪测序文库的构建

5.2 DvFAD1的克隆及序列分析

5.3 DvTPS的功能鉴定及植物转化载体的构建

参考文献

全文总结

硕士期间发表的论文及会议摘要

致 谢