新型多价大肠杆菌噬菌体285P分离鉴定及功能基因组学研究

摘要

细菌耐药性是21世纪全球性的难题和关注的热点。抗菌药物长期、广泛和不合理使用以及抗菌药物的选择压力等原因使耐药菌株不断增多、耐药谱日益扩大，有的菌株甚至对尚未用于临床的新型抗菌药物也表现出了耐药性。喹诺酮类抗菌药物进入我国仅仅20多年，但耐药率却不断上升，如全球销量最大的环丙沙星，大肠杆菌对之耐药率高达60％～70％，肠球菌和葡萄球菌对之耐药率也增加了20％～40％不等。世界卫生组织早在1996年向世界各国发出警告，细菌的耐药性正在不断增强，有可能使结核病再次成为不治之症。鉴于以上原因，研制新一代高效安全廉价的新型抗菌制剂迫在眉睫。 噬菌体作为细菌病毒，能特异感染和裂解宿主菌，自发现之初，它便被定位于进行生物抗菌，早期由于抗生素的发现和发展以及学者对噬菌体基本特性认识的匮乏，相关研究一度陷入低谷，但随着抗生素耐药现象日趋严重，噬菌体生物抗菌重新焕发生机。鉴于噬菌体抗菌的专一宿主性、环境亲和性、经济方便和持续性等特点，噬菌体抗菌应用技术是未来重要的发展方向，是人类有效利用自然资源、进行持续发展的重要途径。相关应用在医学、农业、食品工作和环境保护中已显露身手，并逐趋成熟。 然而，噬菌体的宿主高特异性仍然在很大程度上限制了它的应用，一些噬菌体的宿主谱仅局限在某一科、某一属、某一种甚至某一株细菌，而对其它菌株裂解效果很弱或无治疗作用，使其应用的范围受到很大的限制。而对噬菌体进行人工改造以满足增加噬菌体宿主谱的需要是解决这个问题的关键，目前已经成为研究热点之一。 本课题旨在从医院污水样本中分离新型多价大肠杆菌噬菌体，并观察分析其基本生物学特征和核酸属性，并从基因组学和蛋白组学两方面着手，结合生物信息学相关研究方法，对其进行属性分析和功能研究，探讨噬菌体多价特性的分子识别机制，为下一步进行噬菌体人工改造并应用与生物抗菌领域奠定理论基础。研究内容和结果可以概括为如下几个方面： 1．在对医院污水样本的大规模筛选中，分离到一株新型多价大肠杆菌噬菌体，针对多株大肠杆菌效价均在109pfu/mL以上；通过噬菌体双层琼脂法培养、透射电镜、一步生长曲线、核酸电泳及分光光度测量等技术，观察噬菌斑、超微结构、核酸性质及生长曲线特征，确定噬菌体285P的噬菌斑直径约4-5mm，透明，大小均匀，边缘清楚，无晕环；电镜观察显示噬菌体颗粒呈微球型，边缘光滑，隶属于短尾病毒科(Podoviridae)，头部直径约40-48nm，尾部约为8×23nm；一步生长曲线显示噬菌体285P的5min吸附率为80．3％，潜伏期是21min，平均释放量为88个；分光光度法及核酸酶切法均证实核酸为双链DNA(dsDNA)。 2．利用Shotgun全基因组测序技术完成了噬菌体285P的全基因组测序，大小为39270bp，通过blast比对证实为一株新的噬菌体，并对它进行了基因组注释和进化分析，分析出43个有效ORF，碱基长度从81到3948bp大小不等，利用blast比对预测它们的功能，主要包括尾丝蛋白、尾蛋白、主要衣壳蛋白、溶菌酶、病毒内部蛋白及核酸内外切酶等；并通过SWISS-MODEL对主要蛋白进行了同源建模； 3．结合SDS-PAGE电泳、双向电泳及质谱分析技术，并和基因组学数据相互佐证，确定了噬菌体285P的三条主要蛋白即重要衣壳蛋白、尾蛋白和尾丝蛋白。 4．重点从尾丝蛋白的结构性质等方面对噬菌体285P的宿主识别机制进行了探讨，对其蛋白的一级结构、二级结构和三级结构进行分析，并构建了进化树、氨基酸组分分析、多序列clustal比对以及亲水性、柔韧性、抗原指数和表面可能性等理化性质的分析，利用TMHMM Server v．2．0对尾丝蛋白的跨膜区域进行分析，并与噬菌体T7、BA14进行了比较分析，利用类推法进行演绎，推定噬菌体285P通过尾丝蛋白特异地吸附到特定宿主菌的表面脂多糖外膜中的二糖基残基来实现宿主识别功能，为下一步进行尾丝蛋白的克隆表达及应用研究奠定了基础。 综上所述，本研究首先从大量的环境样本中筛选出了新型多价大肠杆菌噬菌体285P，并对其基本生物学特性和核酸属性进行了观察分析；通过相关蛋白研究技术确定了三条主要蛋白组分，并对他们进行了定性和定量，为下一步功能研究奠定了基础；进行了全基因组Shotgun测序，确定了其39270个碱基组成，并进行了功能注释；对噬菌体的宿主识别器官一尾丝进行了重点探讨，为下一步进行重组表达及将之扩展至其他种属细菌，并进一步研究基因工程改造多价噬菌体技术，应用于环境消毒、兽医学、农业和食品加工处理等领域奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照一览表

声明

前 言

第一部分新型多价大肠杆菌噬菌体285P的筛选及其生物学特征研究

材料和方法

结果与讨论

第二部分新型多价大肠杆菌噬菌体285P功能基因组学研究

材料与方法

结果与讨论

全文结论

致 谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

文献综述:基于噬菌体生物抗菌技术研究进展

附录