β-丙内酯对重组TMV灭活的研究及以TMV为载体对FX22多肽的表达

摘要

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是单组分带有帽子结构的正义单链RNA病毒，基因组全长6395bp。病毒RNA由外壳蛋白(Coat Protien，CP)包装成长约300nm，直径约18nm的杆状病毒粒子。TMV系统感染烟草后，CP表达量可达到被感染烟草总蛋白的7％。TMV的CP亚基由4个α螺旋组成，蛋白的N端和C端暴露在外部，选择在CP的N、C端或CP内部的合适位置插入外源序列，通常可使插入的外源序列展示于病毒粒子的外部。因此TMV常被作为外源小肽的表达载体进行研究。我们实验室在TMV病毒载体的研究工作中，成功构建了TMV-F14、TMV-F11、TMV-S1241等重组TMV，表达了来源于不同动物病毒的多种抗原决定多肽，如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)和SARS冠状病毒等。 随着TMV表达载体的发展，重组TMV的安全性问题越来越受到关注。虽然重组TMV感染性比野生型病毒较弱。然而重组TMV病毒在野外扩散的风险仍然存在。为了解决这一问题，对重组TMV进行灭活处理后再投入使用成为一种安全有效的办法。本文主要使用了β-丙内酯的方法对重组烟草花叶病毒TMV-S1241和TMV-F14进行灭活的研究。β-丙内酯是一种杂环类化合物，其作用机理是能通过与核酸的嘌呤碱基(主要是鸟嘌呤)反应破坏核酸的结构。在β-丙内酯对重组TMV灭活的研究中，发现使用1∶500浓度的β-丙内酯处理72小时，能够将重组烟草花叶病毒TMV-S1241和TMV-F14完全灭活，同时又不破坏TMV-S1241所插入外源小肽的免疫原性。该研究结果表明，β-丙内酯是一种能有效灭活重组TMV的方法。到目前为止，β-丙内酯用于植物病毒的灭活还未有相关报道。这些灭活条件的数据对今后重组TMV病毒的大规模灭活和重组TMV疫苗的生产具有一定的参考价值。 在以TMV为载体表达外源小肽的研究过程中，我们发现并不是所有的重组TMV病毒都能系统感染对野生型TMV敏感的烟草种类。在表达具有抗血栓作用的FX22多肽时，我们发现用融合了FX22多肽序列的重组TMV病毒接种Nicotianatabaccum Samsun nn烟草苗一星期后，接种叶上出现了枯斑症状。这一现象与野生型TMV接种Nicotiana tabacum cv．Samsun NN烟草苗后产生的抗性枯斑很相似。两个星期后Nicotiana tabaccum cv．Samsun nn烟草苗也未形成系统花叶症状。我们推测可能是所插入的外源小肽在蛋白质或核酸的水平上引起了Nicotiana tabaccum cv.Samsun nn烟草苗抗性反应，从而导致了枯斑的产生。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

烟草花叶病毒的介绍

1.植物病毒简介

2.烟草花叶病毒(TMV)基因组的结构与功能

3.TMV表达载体的研究进展

病毒灭活的概述

1.TMV的危害性

2.重组TMV的生物安全性问题

3.病毒灭活的主要方法

参考文献

第二章β-丙内酯对重组TMV灭活的研究

引文

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.实验结果及分析

2.1 β-丙内酯对重组病毒TMV-S6-1灭活的结果

2.2 β-丙内酯对重组病毒TMV-F14灭活的结果

3.讨论

参考文献

第三章以TMV为载体表达抗血栓22肽的研究

引文

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.实验结果及分析

2.1 FX22外源肽的融合和重组TMV的体外转录

2.2 FX22重组TMV接种烟草后的症状

2.3 RT-PCR检测病毒RNA

2.4 SDS-PAGE和Western blot分析结果

3.讨论

参考文献

致谢

作者参与的工作