线性中和表位在抗毒素免疫保护中的作用研究

摘要

一种抗毒素能否有效地中和生物毒素,取决于它结合生物毒素中和表位的能力,因此,中和表位是免疫保护作用的核心靶点.线性中和表位由于其氨基酸序列在一级结构上是连续的,较容易在体外模拟其天然表位.因此,该研究采用线性中和表位作为靶标,应用噬菌体抗体库技术,进行了人源抗毒素制备的研究,旨在获得特异、高亲和力的人源抗毒素,探讨以线性中和表位作为免疫、筛选抗原制备抗毒素的可行性,从而为其它中和抗毒素的制备提供理论和技术依据.该研究依据狂犬病毒糖蛋白Gp线性中和表位G5的氨基酸序列合成表位多肽G5-24,用狂犬病毒Vero疫苗和G5-24表位多肽对三名志愿者进行了免疫,从免疫者外周血淋巴细胞中分离、构建了单链抗体(scFv)基因,应用噬菌体抗体库技术构建抗狂犬病毒人源噬菌体单链抗体库;并用G5-24表位多肽筛选特异噬菌体抗体,分析确定针对靶标G5-24表位多肽的人源scFv基因.对筛选获得的人源抗G5-24 scFv(VL-VH)基因进行了重构,将它们克隆入表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对重组表达蛋白用Ni-NTA柱纯化后,采用尿素梯度透析法进行复性.对scFv(VH-VL)和scFv(VL-VH)的亲和力和热稳定性进行了初步检测.为了提高抗G5-24 scFv的稳定性,应用PCR定点突变的方法分别在VH第44位和VL第100位引入Cys,构建抗G5-24 dsFv VH、VL基因,并将二者在原核表达系统PET-22b(+)/BL21(DE3)中分别表达.dsFv的生物学特性测定,以其亲本scFv作为对照,对其免疫学、稳定性和保护作用进行了评价.上述结果表明,该研究采用线性中和表位G5-24多肽作为免疫和筛选靶标,得到了特异性、高亲和力的人源噬菌体scFv,并成功地对抗G5-24 scFv进行了稳定性改构,制备了功能性人源抗G5-24 dsFv.表明以线性中和表位作为靶标,制备人源抗毒素的技术路线是可行的.

目录

引言

第一部分人源抗狂犬病毒噬菌体展示单链抗体库的构建及筛选

一 G5-24多肽的合成、鉴定及免疫

二人源抗狂犬病毒噬菌体展示单链抗体库的构建

三抗G5-24多肽噬菌体抗体的体外亲和筛选及序列分析

小结

第二部分人源抗G5-24 scFv(VL-VH)基因的重排及其在原核系统中的高效表达

一scFv(VL-VH)基因的重构及序列分析

二scFv(VH-VL)和scFv(VL-VH)的高效表达和纯化

小结

第三部分抗G5-24二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)基因的构建与表达

一抗G5-24 dsFv基因的构建与序列分析

二抗G5-24 dsFv抗体片段的表达与纯化

小结

第四部分抗G5-24人源抗体的生物学活性研究

一抗G5-24人源抗体的生物学特性的研究

二抗G5-24人源抗体中和活性的研究

小结

总结

参考文献

致谢

附录一中英文缩略词表

附录二发表综述单链抗体稳定性的研究现状

附录三发表论文

1人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选