华东地区沼气池中细菌群落结构及其多样性的研究

摘要

我们通过对沼气池中微生物群落进行分类学和生态学层面上的研究，对此环境中真细菌和古细菌的多样性和群落结构有了初步认识。 首先，建立了复杂固态环境中微生物基因组DNA的提取方法。使用此方法，对崇明岛长江口滩涂泥浆和校园植物根际土壤中微生物基因组DNA进行了提取。 其次，对崇明沼气池中的微生物群落进行了初步探索。从沼气池浆中直接提取DNA，由此构建16S ribosomal DNA(rDNA)文库，并测序。我们基于16S rDNA序列对微生物群落的多样性和结构进行研究。研究表明在沼气池的厌氧环境中，微生物群落是一个复杂和未知的群体。 随后，采集了华东地区（上海市的崇明，浙江省的海宁，江苏省的班庄和涟水）沼气池浆样品，通过横向比较来研究沼气池微生物群落的结构和多样性。我们用95％序列相似度来定义OTU（Operational Taxonomic Units），并计算出每个样品中实测序列的OTU数目，以及相对应的CHAO1值和ACE值。在微生物种群的多样性方面上，所有四个样品中，真细菌的OTU数目是古细菌的3-3.5倍；选取各个样品中全部OTU的代表性序列绘制系统发育树，并对每个OTU中的部分序列进行BLAST，根据系统发育树所呈现的全部OTU之间的关系和BLAST的结果，把它们分成若干个组来进行分析，古细菌和真细菌都划分为七个组。在古细菌的群落中，大多数的序列集中在Group2中，并和Methanogenium的序列相近，是一类利用二氧化碳作为碳源，氢分子作为电子供体的产甲烷菌。在真细菌的群落中，Group1中的序列和Syntrophomonas的序列相近，是一类在产甲烷环境中的β饱和脂肪酸氧化菌。Group2中的序列属于Clostridium，对沼气池中多糖和寡糖的降解起重要作用。而Group7中的序列代表着新的菌种。 通过对四个沼气池中古细菌群落和真细菌群落组成情况的对比分析，我们发现，丰富种占据个体数量的多数，但种群数不多；稀有种只占个体数量的少数，但种群数很多。我们使用了Shannon指数和Simpson指数来评估每个样品中微生物种群的丰富度，在全部样品中，真细菌的种群丰富度都高于古细菌的种群丰富度。

目录

文摘

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声明

第一章 绪论

1.1 环境微生物学

1.1.1环境微生物学的发展

1.1.2环境微生物学的研究方法

1.1.3环境微生物学研究中的分子标记

1.1.4宏基因组学的研究进展

1.1.5环境微生物学的研究意义

1.2 沼气池的利用及研究

1.2.1我国沼气池的发展

1.2.2沼气池的利用

1.2.3沼气池中的产甲烷古细菌

1.3 研究背景和目的

第二章材料和方法

2.1 实验室仪器和设备

2.2软件及其相关知识的介绍

2.3样品的采集

2.4 DNA的提取和保存

2.4.1 复杂固态环境中微生物基因组DNA的提取方法

2.4.2 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit的提取方法

2.5 PCR引物

2.5.1真细菌引物

2.5.2古细菌引物

2.6 高效电击感受态细胞的制备

2.7 PCR-16SrRNA克隆文库构建

2.7.1 PCR的相关参数

2.7.2 PCR产物的连接

2.7.3 电击转化

2.8 96孔板抽提质粒及测序

2.8.1试剂的制备

2.8.2 96孔板抽提质粒

2.8.3测序

2.9序列的处理及群落结构和多样性分析

2.9.1序列处理基本流程

2.9.2 MEGA 4.0的使用

2.9.3 DOTUR的使用

第三章结果与讨论

3.1 复杂固态环境中微生物基因组DNA的提取

3.1.1 崇明岛长江口滩涂泥浆中微生物基因组DNA的提取

3.1.2校园中植物根际土壤中微生物基因组DNA的提取

3.2 DNA的提取及PCR-16S rRNA克隆文库构建

3.3 96孔板抽提质粒及测序

3.4 序列的处理及NCBI登录号

3.5 崇明沼气池中微生物群落的分析

3.5.1 崇明沼气池中的古细菌群落

3.5.2崇明沼气池中的真细菌群落

3.6 华东地区沼气池中古细菌和真细菌多样性的分析

3.6.1对DOTUR数据的处理和分析

3.6.2 克隆序列OTU的划分

3.6.3古细菌多样性的分析

3.6.4真细菌多样性的分析

3.6.5多样性指数的计算和评定

3.7 华东地区沼气池中古细菌和真细菌群落结构的分析

3.7.1 古细菌群落结构的分析

3.7.2真细菌群落结构的分析

第四章结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

4.2.1 沼气池微生物研究的展望

4.2.2环境微生物研究技术的展望

参考文献

附录

作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文

作者在攻读硕士学位期间所参与的项目

致 谢