基于P64K蛋白的胃泌素G17治疗性疫苗的研究

摘要

胃泌素(gastrin,GAS)是胃窦和十二指肠粘膜G细胞分泌的多肽类激素,主要生理作用是促进胃酸分泌和胃肠道粘膜的生长.研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤自泌性的生长因子,通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长.胃肠道肿瘤的抗胃泌素治疗分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗.该课题的目的是开发一种基于脑膜炎球菌P64K蛋白的针对胃肠道肿瘤的胃泌素G17治疗性疫苗.我们选用人胃泌素G17 N端9个氨基酸的B细胞表位(Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu)作为靶位,这个表位为胃泌素G17和甘氨酸延伸型胃泌素G17所特有,因而产生的抗胃泌素G17抗体不会与G34和CCK发生交叉反应.P64K蛋白是来自于脑膜炎奈瑟氏球菌的一种外层膜蛋白.P64K蛋白作为载体蛋白可以帮助激活特异性体液免疫反应,近年来研究显示P64K较传统载体蛋白BSA、TT等有更好的免疫增强效果.我们选择P64K蛋白,通过一段多肽交联桥(Gly-Gly-Gly-Gly-SeR)与G17的B细胞表位交联或者是构建G17P64K融合蛋白来作为治疗性疫苗,诱导机体产生抗胃泌素G17的抗体从而中和并清除内分泌或者是源自肿瘤细胞自分泌的胃泌毒,达到治疗胃肠道肿瘤的目的.我们从脑膜炎球菌中通过PCR克隆得到了P64K基因,构建了P64K基因和G17P64K基因的pET28a表达载体,并在大肠杆菌中得到了高表达.目的蛋白经硫酸铵沉淀、疏水层析、分子筛层析和阴离子层析得到纯度超过90％的样品.FMOC固相法化学合成多肽pyro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys.MBS法交联多肽与载体蛋白P64K及DT.制备抗胃泌素G17抗体试验分为5组:合成多肽组,P64K蛋白组,DT多肽交联组、P64K多肽交联组和G17P64K融合蛋白组,分别加氟氏佐剂后免疫兔.经两次加强免疫后在DT多肽交联组和P64K多肽交联组动物血清中产生了高滴度的抗胃泌素G17抗体.细胞水平的体外活性评价试验显示抗体有较好的抑制肿瘤生长的生物学活性.

目录

缩略词表

第一章前言

1.1人胃泌素概况

1.1.1胃泌素的合成

1.1.2胃泌素的生物学活性

1.1.3胃泌素的作用方式

1.2胃泌素与胃肠道肿瘤的关系

1.2.1肿瘤细胞中胃泌素基因的表达

1.2.2胃泌素在恶性肿瘤中的可能作用机制

1.3胃肠道肿瘤抗胃泌素治疗的研究进展

1.3.1胃泌素分泌抑制

1.3.2胃泌素受体拮抗剂

1.3.3反义寡核苷酸

1.3.4抗胃泌素抗体

1.4人胃泌素G17疫苗靶位的选择

1.5 P64K蛋白的特性

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

2.1.2质粒

2.1.3抗体

2.1.4细胞及实验动物

2.1.5限制性内切酶及工具酶

2.1.6 DNA及质粒回收试剂盒

2.1.7核酸及蛋白分子量标准

2.1.8所有合成的引物

2.1.9主要仪器

2.1.10主要试剂

2.1.11其它材料

2.2方法

2.2.1培养基

2.2.2主要溶液

第三章实验步骤

3.1目的基因的克隆

3.1.1脑膜炎球菌P6K基因的克隆

3.1.2没有终止密码子的P64K蛋白基因的克隆

3.1.3 P64KHis6蛋白基因的克隆

3.1.4 P64KZtag蛋白基因的克隆

3.1.5 G17P64K融合蛋白基因的克隆

3.2表达载体的构建

3.2.1 P64K蛋白表达载体pET28a-P64K的构建

3.2.2去掉终止密码子的P64K蛋白表达载体pET28a-P64K’的构建

3.2.3 P64KHis6蛋白原核表达载体pET28a-P64KHis6的构建

3.2.4 P64KZtag蛋白原核表达载体pET28a-P64KZtag的构建

3.2.5 G17P64K融合蛋白基因表达载体pET28a-G17P64K的构建

3.3表达载体转化表达菌株及目的基因的诱导表达

3.3.1表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞

3.3.2目的基因的诱导表达

3.4目的蛋白的纯化

3.4.1目的蛋白表达方式和表达水平的确定

3.4.2蛋白的硫酸铵沉淀纯化

3.4.3蛋白样品的Buty1疏水层析

3.4.4蛋白样品的分子筛层析

3.4.5蛋白样品的Q柱阴离子层析

3.4.6蛋白样品的Ni亲和层析

3.4.7蛋白样品的S柱阳离子层析

3.4.8蛋白的N端氨基酸测序

3.4.9用Lowry法测定样品中的蛋白浓度

3.5 工程菌5L生物反应器培养

3.6 G17多肽的化学合成

3.7合成多肽与载体蛋白P64K及DT的化学交联

3.8兔抗胃泌素G17抗体的制备与纯化

3.8.1兔抗胃泌素G17抗体的制备

3.8.2兔抗胃泌素G17抗体滴度的测定

3.8.3兔抗胃泌素G17抗体的纯化

3.9兔抗胃泌素G17抗体的体外活性评价

3.9.1 SW480细胞的培养

3.9.2兔抗胃泌素G17抗体的体外活性评价

3.10兔抗胃泌素G17抗体的体内活性评价

第四章实验结果

4.1目的基因的克隆

4.1.1 P6K基因的克隆

4.1.2去掉终止密码子的P64K’基因的克隆

4.1.3 P64KHis6基因的克隆

4.1.4 P64KZtag基因的克隆

4.1.5 G17P64K基因的克隆

4.2表达载体的构建

4.2.1 P64K基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析

4.2.2去掉终止密码子的P64K’基因表达载体pET28a-P64K’的构建与酶切鉴定及序列分析

4.2.3 P64KHis6基因表达载体pET28a-P64KHis6的构建与酶切鉴定及序列分析

4.2.4 P64KZtag基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析

4.2.5 G17P64K基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析

4.3表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

4.3.1 pET28a-P64K表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

4.3.2 pET28a-P64KHis6表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

4.3.3 pET28a-P64KZtag表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

4.3.4 pET28a-G17P64K表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

4.4目的蛋白的纯化

4.4.1目的蛋白表达方式和表达水平的鉴定

4.4.2蛋白的硫酸铵沉淀纯化

4.4.3 P64KHis6融合蛋白Ni柱亲和层析纯化效果图

4.4.4 P64KZtag蛋白S柱阳离子层析纯化

4.4.5蛋白的纯化

4.4.6蛋白的N端氨基酸测序

4.5工程菌5L生物反应器培养

4.6 G17多肽的化学合成

4.7合成多肽与载体蛋白P64K及DT的化学交联

4.8兔抗胃泌素G17抗体的制备与纯化

4.8.1兔抗胃泌素G17抗体滴度的测定

4.8.2兔抗胃泌素G17抗体抗体的纯化

4.9兔抗胃泌素G17抗体抗体的体外活性评价表

4.10兔抗胃泌素G17抗体抗体的体内初步活性评价

第五章讨论

结论

参考文献

致谢

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