金黄色葡萄球菌表面蛋白的原核表达、纯化及免疫效应研究

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)可引起一系列不同程度的感染;一个不太严重的伤口感染可发展为恶性的败血症、骨髓炎、脓毒性关节炎或是心内膜炎.S. aureus更是医院感染中最常见的病原菌之一.甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant S. aureus,MRSA)菌株,可抵抗大多数临床上应用的抗生素.令人忧虑的是,MRSA菌株对治疗葡萄球菌感染最为有效的抗生素--万古霉素的敏感性日益降低,这些对万古霉素不敏感的金黄色葡萄球菌(Vancomysin-intermediate S.aureus,VISA)菌株的出现使人们产生了金葡菌感染不能治愈的恐惧感,因此必须寻找到一种有效的治疗方法.结论 我们所获的金黄色葡萄球菌表面蛋白是可溶性的,较好地保持了其免疫原性,实现了其在大肠杆菌中的高量表达;我们首次尝试将金葡菌的fnb和cna基因连接起来,构建双价疫苗从而扩大了蛋白疫苗的保护范围,使之可以防治绝大部分金葡菌株:动物实验表明,这些蛋白具有良好的体液免疫和细胞免疫应答的效果;开发金葡菌ECMBPs重组疫苗具良好的应用前景.

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1文献综述

1.1寻求新的抗S. aureus感染的疫苗

1.2细胞外结合基质蛋白(ECMBPs)

1.3 ECMBPs是真正的毒力因子吗

1.4几种重要的MSCRAMMs

2选题依据

3实验研究

3.1金葡球菌表面蛋白cna，fnb基因在大肠杆菌中的克隆表达、纯化

3.1.1材料

3.1.2仪器

3.1.3方法

3.2金黄色葡萄球菌表面蛋白can-fnb基因在大肠杆菌中的融合表达

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3 Trx-FnBP、Cna、Trx-Cna、TrxCn-fnBP蛋白免疫效应研究

3.3.1材料

3 3 2实验方法

4实验结果

4.1金葡球菌表面蛋白cna，fnb基因在大肠杆菌中的克隆表达、纯化结果

4.1.1目的基因的扩增

4.1.2 fnb-T质粒，cna-T质粒的构建

4.1.3序列测定

4.1.4表达质粒trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的构建

4.1.5重组trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的表达

4.1.6蛋白纯化结果

4.1.7纯化蛋白的定量

4.2金葡菌表面蛋白can-fnb基因在大肠杆菌中的融合表达、纯化结果

4.2.1目的基因的扩增

4.2.2 Cna+fnb-T质粒的构建

4.2.3序列测定及分析

4.2.4 Cna+fnb-pET-32a(+)质粒的构建

4.2.5 Cna-fnBP蛋白的表达结果

4.2.6 Cna-fnBP蛋白的纯化

4.2.7 Cna-fnBP蛋白的定量结果

4.3金黄色葡萄球菌表面蛋白免疫效应结果分析

4.3.1免疫Balb/c雌性小鼠血清抗体滴度变化

4.3.2免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验

4.3.3中性粒细胞的调理吞噬作用

4.3.4免疫保护实验

4.3.5 Western Blot分析

5讨论

5.1引物的设计及PCR反应条件的优化

5.2表达载体的选择

5.3 ECMBPs作为疫苗的研究

5.4靶抗原基因的融合是新型疫苗发展的新方向

5.5间接ELISA测抗体效价结果分析

5.6动物免疫保护实验方案

总结

致谢

参考文献

攻读学位期间的主要科研成果