早老素双敲除小鼠神经退行性病变及复杂环境对其逆转作用的分子机理研究

摘要

老年痴呆(Alzheimer'sdisease，AD)是老年人中最普遍的一种以脑内Aβ水平显著升高为特征的中枢神经系统退行性疾病，早老素基因(Presenilin，PS)在AD病理学中起重要作用，揭示其生理功能对阐明AD的具体分子机制具有重要意义。早老素是跨膜的天冬氨酸蛋白酶，有PS1和PS2两种形式，基因敲除研究表明，条件性PS1和PS2双敲除(PSconditionalknockout，cDKO)小鼠表现出类似AD的进行性的神经退行性病理变化，包括认知能力衰退和前脑退化等，但是这些病理症状不依赖于脑内Aβ水平，其确切的分子机理还未阐明。本研究采用基因芯片和定量PCR技术分别考察3月龄和10月龄cDKO小鼠皮层和海马内发生的基因表达变化，分析差异表达基因和相关的信号通路，初步探讨cDKO小鼠发生退行性病变的分子机理。 复杂环境处理(Environmentalenrichment，EE)是把动物以更大的群体放在一个更大的、放有多种玩具的笼子或其他饲养环境里，使动物有更大的机会进行复杂的社会性交流和探索的一种处理方式。EE已被证实能改善多种正常和认知能力缺陷动物的学习记忆能力，诱导动物脑部的形态学变化，还对许多神经退行性疾病及其他病理过程具有良好的延缓和逆转作用。为了考察EE是否能减轻cDKO小鼠的记忆缺陷和前脑退化，本实验对1月龄的cDKO小鼠进行5个月的每天3小时的复杂环境暴露，然后进行行为学和组织学检测，以考察EE诱导的变化。接着运用高密度基因芯片技术、荧光实时定量PCR技术、免疫组化以及Westernblotting等分子生物学技术考察EE引起的基因表达变化，初步探讨EE对cDKO小鼠的生理效果的分子机理，同时为开发AD的治疗方案提供一些理论基础。 1.PS1/PS2条件性双敲除小鼠神经退行性早期基因表达谱分析运用基因芯片技术考察了cDKO小鼠3月龄时皮层和海马基因表达的变化，分别鉴别到56和46个基因的表达发生了改变。用定量PCR技术检测了一些重要基因的表达，其结果与芯片结果相符。功能分析揭示，这些差异表达基因主要可以归入免疫和炎症、代谢、细胞黏附、信号转导、结构蛋白和肿瘤相关基因等几类。其中，免疫炎症相关的基因包括补体成员和Cathepsin家族蛋白酶的表达显著上调。此外，突触后受体AMPA受体亚基GluR1和GABA受体α亚基Gabra2及蛋白激酶Mapk8等都与AD神经病理学有关，它们的基因在cDKO小鼠海马内表达水平降低。提示，这类基因的表达异常可能与神经退行性病理过程的起始有关。 2.PS1/PS2条件性双敲除小鼠神经退行性晚期基因表达谱分析运用基因芯片技术在10月龄的cDKO小鼠的皮层和海马中分别检测到355和281个差异表达基因。根据基因的功能，这些基因可以分成免疫炎症反应、代谢、信号转导、转录、转运、钙信号、细胞黏附、凋亡和细胞骨架蛋白等类别。最显著的是，分别有53和56个参与免疫和炎症反应的基因在双敲除的小鼠皮层和海马中表达发生改变，且绝大多数基因，包括星形胶质细胞和小胶质细胞的标记、Cathepsin家族蛋白酶、淋巴细胞表面抗原、趋化细胞激素配基、补体系统成员和组织相容性抗原家族成员等表达上调。定量PCR分别检测了皮层和海马中一些与免疫炎症有关的差异表达基因及相关基因的表达，结果发现，这些基因都在cDKO小鼠脑中表达上调。提示，免疫系统的过度激活是神经退行性晚期的cDKO小鼠分子水平的重要特征，可能是导致严重的神经退行性表型的内在机制之一。 其他一些重要基因，包括腺苷环化酶(Sacy)、Neuregulin-3、TGFβⅡ、Egr2、钾通道相关的基因、Transthyretin、VE-Cadherin等也在cDKO小鼠脑内发生表达变化，可能与神经系统功能障碍存在一定关系。另外，定量PCR还检测到神经元特异性标记MAP-2的表达在cDKO小鼠皮层中显著下调，在海马中也略有减少，表明10月龄的cDKO小鼠脑内神经元数减少。 3.复杂环境处理部分逆转cDKO小鼠神经退行性病理症状对cDKO小鼠进行5个月的复杂环境暴露后，用开放场实验、新物体识别和情境式恐惧性条件反射检测正常饲养和EE的cDKO小鼠的运动能力和海马依赖的学习记忆能力。结果表明，EE没有影响cDKO小鼠的运动能力，但对海马依赖的记忆有明显的增强作用。 用HE染色以显示野生型(Wt组)、正常饲养(Naive组)和EE(Enriched组)的7月龄cDKO小鼠的脑部形态，并进行比较，结果表明，Naive组与Wt组相比，表现出侧脑室和第三脑室扩大，皮层厚度减小，分层模糊，海马分子层和胼胝体厚度减小等脑部形态变化。表明cDKO小鼠的脑部形态退化在7月龄时已出现。而Enriched组与Naive组相比，侧脑室和第三脑室减小，皮层厚度增大，但仍无明显分层，海马分子层和胼胝体厚度稍有增大。表明EE能部分逆转cDKO小鼠的脑部形态变化。 综合行为学和形态学结果，EE能减轻cDKO小鼠的记忆能力缺陷和前脑退化，表现出部分逆转神经退行性症状的作用。这为开发治疗AD的方案提供了新思路。 4.复杂环境处理部分逆转cDKO小鼠神经退行性症状的可能分子机理为探讨EE的生理效果的可能分子机理，运用分子生物学技术考察了EE诱导的cDKO小鼠皮层和海马基因表达变化。 基因芯片共检测到皮层中有50个基因的表达发生改变，其中49个基因在Enriched组皮层中上调。对这些基因的分析发现，与免疫炎症、信号转导、转录、细胞骨架、有丝分裂、氧化修复和转运等生理过程相关的基因的表达受到环境所影响。虽然有4个参与免疫炎症反应的差异表达基因，芯片、定量PCR和蛋白水平研究结果显示，EE并未引起cDKO小鼠皮层中与炎症有关的基因的整体下调。但编码泌乳激素、谷氨酸受体δ2亚基、神经营养因子及几个重要转录因子的基因的表达水平在Enriched组中升高，表明在cDKO小鼠的皮层中，复杂环境饲养可能不是通过抑制炎症反应，而是调节其他基因和生理过程比如神经元生存、转录等及诱导BDNF表达，起到缓解皮层退化的作用。 基因芯片在海马中鉴别到90个基因的表达变化，其中80个基因的表达在Enriched组发生下调。尽管有与细胞骨架和结构蛋白、信号转导、转运相关的基因的表达受到EE影响，Enriched组cDKO小鼠海马中最显著的变化是，参与免疫炎症反应的基因包括趋化细胞激素配基、组织相容性抗原家族成员、干扰素诱导蛋白和寡腺苷酸合成酶等的表达水平显著降低。结合定量PCR实验结果，许多在10月龄的cDKO小鼠海马内上调的免疫炎症相关基因在EE后的7月龄的cDKO小鼠海马内表达水平降低。对星形胶质细胞标记GFAP进行蛋白水平的检测，结果发现，7月龄的Naive组海马中GFAP蛋白水平相对于Wt组显著增加，但EE后其表达相对于Naive组降低。综合本实验及有关文献的结果，EE抑制了cDKO小鼠海马内一些与免疫炎症相关的基因的表达上调，这可能是EE改善海马依赖的记忆和减轻海马萎缩的分子机理。研究还发现，EE组海马分子层的神经元数相对于Naive组增加，推测可能与海马内神经元凋亡减少有关。 EE对cDKO小鼠神经退行性病理变化的改善作用在皮层和海马中可能是通过不同的途径实现的。尽管本研究并未彻底阐明EE改善认知能力和减轻神经退行性病理症状的具体分子机制，但为进一步的研究和开发治疗神经退行性痴呆的方案提供了理论依据。

目录

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摘要

第一章PS1/PS2条件性双敲除小鼠基因表达谱分析

前言

第一节PS1/PS2条件性双敲除小鼠神经退行性早期基因表达谱分析

第二节PS1/PS2条件性双敲除小鼠神经退行性晚期基因表达谱分析

材料和方法

结果

讨论

版图与说明

第二章 复杂环境处理部分逆转cDKO小鼠神经退行性表型

第三章 复杂环境处理的逆转作用的分子机理初探

第四章文献综述

参考文献

附录

已/待刊文章

致谢