哺乳动物sterile twenty 20-like激酶3（mst3）在小鼠胚胎的表达及其相关机制的初步研究

摘要

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。近年来，丝裂原活化蛋白激酶的研究，使人们对蛋白质磷酸化在信号转导中的作用有了进一步的认识。多种细胞生理过程，如生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等都涉及到MAPK信号转导通路的调节。从单细胞酵母到人类都保留了保守的MAPK激酶级联通路，即MAPKKK(MAPkinasekinasekinase)→MAPKK(MAPkinasekinase)→MAPK(MAPkinase)。外界因素刺激引起MAPKKK磷酸化激活，然后MAPKKK磷酸化激活MAPKK，继而激活MAPK。 STE20是酿酒酵母的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于MAPK级联通路的上游。该家族包括PAK和SPS1两个亚族。mst3是哺乳动物STE20丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，1997年首次从hela细胞cDNA文库中分离出来，属于SPS1亚族，包含一个N端催化功能区和一个C端调节功能区。目前已知caspase酶切激活mst3后促进细胞凋亡，但其他生理机能是未知的。本研究对mst3在小鼠胚胎发育过程中的表达及其作用机制进行探索性研究，为今后的研究奠定理论基础和实验依掘，具体内容包括： 一、mst3-pCMV-tag3c重组质粒的构建和mst3碳端抗体特异性的检测鉴定用EcoRI和ApaI限制性内切酶从mst3-pCDNA3.0'上切取1230bp的mst3cDNA片断。按pCMV-tag3c载体的多克隆位点用EcoRI和ApaI限制性内切酶切开pCMV-tag3c载体。pCMV-tag3c和mst3的酶切片断16℃经T4连接酶作用形成重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切进行鉴定并进行核苷酸序列测定。结果表明：成功克隆到mst3全编码基因片断，序列与GenBank中收录的mst3cDNA序列一致。mst3-pCMV-tag3c重组质粒在LipofectAMINETM2000脂质体介导下转染入哺乳动物细胞293T，通过免疫荧光共定位方法鉴定mst3碳端抗体的特异性。 二、mst3特异性在小鼠胚胎骨骼肌组织表达，表达具有时空差异性利用光镜免疫组织化学方法对小鼠胚胎发育过程中mst3的组织表达进行实验观察，结果表明：1.mst3在小鼠胚胎发育过程中的组织分布非常特异：特异地在胚胎的骨骼肌组织表达。2.mst3在骨骼肌的表达存在一定的时空差异性。mst3在胚胎第10.5d开始在胚胎表达，仅特异性地表达于肌节，在肢芽未见表达。胚胎第11.5d，mst3开始在前肢芽表达，后肢芽未见表达。胚胎第12.5d，mst3开始在颅面和后肢芽表达，在前肢芽的背腹部肌肉团表达。胚胎第13.5d，mst3在初次形成的初级肌管表达。胚胎第16.5d，mst3在初次形成的次级肌管表达。 三、BrdU增生染色和TUNEL凋亡染色初步探讨mst3在胚胎骨骼肌发育过程中的可能机制应用免疫组化方法连续切片和激光共聚焦技术观察胚胎第10.5dmst3的表达与细胞增生，同时也应用免疫组化方法连续切片观察胚胎第10.5d和第11.5dmst3的表达和细胞凋亡的关系，激光共聚焦技术观察胚胎第11.5dmst3的表达和细胞凋亡的关系，以探讨mst3在胚胎第10.5d的表达是否通过促进或抑制细胞增生和凋亡在小鼠胚胎骨骼肌发育中起作用。结果表明：mst3的表达与细胞增生和凋亡没有显著相关性，可能通过别的机制调控骨骼肌发育。 根据以上实验结果，我们得出以下结论：mst3与小鼠胚胎骨骼肌发育密切相关。mst3从胚胎发育早期开始就特异性表达于肌节，在骨骼肌组织的表达具有时空特异性，可能和骨骼肌的分化、成熟、维持有关。但具体的机制尚需进一步的实验证明。今后的工作应针对其调控作用的分子机制进行更深入的研究，以全面揭示mst3的功能作用。

目录

学位论文独创性声明及学位论文授权使用声明

第一部分mst3-pCMV-tag3c重组质粒的构建和mst3C-端抗体特异性的鉴定

第二部分光镜免疫组织化学方法研究mst3在小鼠胚胎组织中的表达

第三部分mst3在小鼠胚胎骨骼肌发育过程中的机制初步研究

综述

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表的论文

致谢