醌类和硒类化合物对骨骼肌型钙释放通道的调控作用研究

摘要

氧化还原环境对机体细胞具有重要影响，特别是当钙释放通道的氧化还原环境发生变化时，会导致胞内的钙信号转导和钙调控机制发生变化，严重时会导致诸多疾病。肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)中的ryanodine receptor(RyR)是胞内重要的钙释放通道之一，它对氧化还原环境异常敏感，是氧化胁迫主要作用靶点之一。前期工作证明不同的巯基氧化剂能有效影响骨骼肌SR的钙调控机制，并发现在这些氧化剂与SR反应过程中产生了重要的氧化还原介质--超氧自由基(superoxide，O2·-)，但它在氧化剂对SR的调控过程中的作用目前尚不明朗。 本研究以提取的兔骨骼肌肌质网(SR)囊泡和钙释放通道/ryanodine receptor(RyRl)为研究对象，考察了萘醌(naphthoquinon，NQ)和硒类(selenium，Se)化合物以及伴生的O2·-对骨骼肌型钙释放通道(RyRl)的调控作用，并初步探讨这些氧化剂对RyRl门控的影响机制。 实验利用紫外和荧光分光光度法定量检测反应伴生O2·-阴离子产率和通道蛋白自由巯基数量的变化。采用[3H]-ryanodine结合实验、SR囊泡钙释放动力学实验、单通道活性检测以及通道蛋白的氧化还原电势变化等实验检测了NQ类和Se类化合物对SR上RyRl活性和功能状态的影响。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验检测氧化剂导致的过氧化环境对SR上各蛋白的影响。 结果发现所考察的巯基氧化剂对RyRl的活性和氧化还原电势具有双相性影响，并伴有浓度依赖性的O2·-产生，同时通道的自由巯基数量随氧化剂浓度增加而减少。另外，在高浓度氧化剂导致的过氧化环境下，与胞内钙转运和钙平衡机制相关的RyRl、钙泵等蛋白因巯基被氧化而发生错误交联，对蛋白的功能造成严重损伤。超氧岐化酶(superoxide dismutase，SOD)可以有效降低上述影响。推测除了氧化剂的直接氧化作用外，伴生O2·-在这类氧化剂调控RyR1的机制中也扮演了重要角色。超氧作为胞内信号分子，通过逐步氧化RyR1上那些对氧化环境具有不同敏感程度的自由巯基职能群，加重氧化损伤，并参与胞内钙调动和钙平衡机制的调控，这可能是在氧化胁迫环境下以蛋白质为中心的细胞损伤的分子作用基础之一。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

第一节研究背景

1.氧化还原与活性氧

2.巯基/二硫键转换反应

3.巯基氧化剂(萘醌类和硒类化合物)

4.ROS和信号分子Ca2+的关系

第二节研究对象

1.肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)

2.钙释放通道/ryanodine receptor(RyR)

第三节研究意义与内容

1.研究意义

2.研究内容

第二章材料与方法

第一节试剂

第二节实验仪器及原理介绍

第三节实验方法

1.SR囊泡的制备和蛋白浓度测定

2.通道蛋白RyR1的提纯和蛋白浓度测定

3.伴生O2·-阴离子的测量

4.提纯RyR1的自由巯基量的定性测定

5.[3H]-ryanodine结合实验和结合初速率的测定

6.被动钙负载后的SR囊泡钙释放速率的测量

7.反应液的氧化还原电势的确定和测定

8.人造脂质双分子层上重构RyR1单通道的开放率的测定(本实验数据由美国Portland State University叶雁萍提供)

9.SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和电洗脱回收电泳实验

10.Western Blotting检测氧化剂处理后发生cross-linking的蛋白

11.统计学处理

第三章实验结果

第一节超氧参与氧化剂对骨骼肌型钙释放通道的调控作用

1氧化剂诱导O2·-产生

2巯基氧化剂导致通道蛋白自由巯基数量减少

3超氧参与氧化剂对RyR1钙释放机制的双相调控

4超氧参与了氧化剂对ryanodine受体的氧化还原电势的影响

第二节氧化剂导致SR囊泡内蛋白质发生交联

1氧化剂导致SR上蛋白间的交联(cross-linking)

2蛋白的交联主要是RyR1、Myosin和钙泵等蛋白被氧化导致的

3 Western Blotting检测RyR1是否参与形成交联复合物

第四章总结与讨论

第一节总结

第二节讨论

参考文献

附录 硕士期间发表论文

后记(致谢)