通过体外DNA改组技术获得新的植物强耐盐Na/H逆向转运蛋白基因

摘要

土壤盐渍化是限制植物生长和降低农作物产量的一个重要的非生物胁迫因素。为了应对盐胁迫，植物通常采取一系列的适应调节机制，主要包括渗透调节和离子均衡等。植物通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)将胞质过量Na+区隔化到液泡中，一方面可以降低胞质Na+浓度，另一方面还可以起到渗透调节的作用，促进细胞吸水，是一种经济有效的维持Na+均衡的方式。在不同植物中过量表达植物Na+/H+ antiporter基因均显著提高了转基因植物的耐盐性，说明了植物液泡膜Na+/H+ antiporter对植物耐盐起着非常重要的作用。DNA改组(DNA Shuffling)技术是目前对于蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效的分子生物学方法，这一技术在提高酶活性、改变底物专一性和改善蛋白质（酶）的性能等方面具有广泛的应用前景。在实际生产应用上，目前在植物中已克隆的Na+/H+ antiporter基因的Vmax相对较低，耐盐性不强，这很大程度上限制了该基因在作物分子育种中的应用。鉴于此，本课题利用DNA Shuf fling技术结合在酵母中异源表达改组基因文库以筛选获得活性显著提高、能耐受高浓度盐的新Na+/H+ antiporter基因，同时对植物Na+/H+ antiporter结构与功能的关系进行进一步的研究。本研究主要内容如下：
　　 ⑴拟南芥Na+/H+ antiporter基因AtNHX1的DNA改组及在酵母突变体中的筛选。用DNaseⅠ对AtNHX1进行随机片段化，回收其中100-200bp的小片段，通过无引物PCR使小片段重组，最后经Primer PCR扩增得到含有重组AtNHX1片段的重组基因库。将扩增得到的含有重组AtNHX1片段连接到酵母表达载体pYPGE15中，利用乙酸锂技术转化酵母Na+/H+ antiporter突变体W303△enal-4△nhxl，构建表达重组基因库。将酵母转化子涂布在含100mM NaC1的APG选择性平板中进行高通量筛选，得到了一个盐耐受性显著提高的突变株，其中含有的改组Na+/H+antiporter基因我们命名为AtNHXS1。
　　 ⑵耐高盐Na+/H+ antiporter新基因AtNHXS1的序列分析及蛋白特性分析。序列分析表明，AtNHXS1较AtNHX1有7个核苷酸发生突变，并有42个核苷酸缺失，这个缺失造成了翻译的提前终止。AtNHXS1表达的蛋白含有4个氨基酸的突变，分别是L29P，S158P，Y241P和F242L，并在C末端有296个氨基酸的缺失。酵母功能互补试验显示，AtNHXS1表达的Na+/H+逆向转运蛋白较AtNHX1基因的表达产物耐NaCl能力提高了一倍。且表达AtNHXS1的酵母比表达AtNHX1的酵母中能富集更多的Na+和稍微多一些的K+。分别将GFP基因融合到AtNHX1和AtNHXS1的C末端，转入酵母中。激光共聚焦结果显示，AtNHXS1和AtNHX1表达的蛋白均定位于酵母液泡及液泡前极囊泡中。提取表达AtNHX1和AtNHXS1的酵母突变株的完整液泡，利用吖啶橙标记荧光淬灭法分别测定了AtNHX1和AtNHXS1表达蛋白的离子交换活性，发现AtNHXS1表达蛋白的Na+/H+的Vmax较AtNHX1表达蛋白提高了约一倍，同时K+/H+的Vmax有小幅提高。此外，我们利用PCR介导的定点突变技术分别构建了二个AtAHX1单基因突变和一个C末端缺失突变，转入酵母突变体中进行酵母互补实验。结果显示，分别表达含L29P，S158P和C末端296AA缺失的AtNHX1突变体的酵母耐受NaCl、LiCl、KC1和潮霉素的能力与AtNHXS1类似。
　　 ⑶AtNHXS1新基因植物表达载体的构建及拟南芥的遗传转化。分别构建了植物表达载体 pCAMBIA1301-35SN-AtNHX1和pCAMBIA1301-35SN-AtNHXS1，并通过冻融法分别转入农杆菌GV3101。利用渗透法转化拟南芥，筛选得到了转AtNHX1的纯合子和转AtNHXS1的纯合子，作为下一步耐盐性检测的材料。
　　 ⑷转基因拟南芥的分子鉴定及耐盐性检测。分别提取转AtNHX1和转AtNHXS1基因的拟南芥品系的基因组总DNA，利用PCR和PCR Southern blotting技术对转基因拟南芥进行分子鉴定。定量RT-PCR研究发现，转入AtNHX1的拟南芥和转入AtNHXS1基因的拟南芥中Na+/H+antiporter基因的表达量明显高于野生型植株。200mM和300mM NaCl处理下，过量表达AtNHX1的拟南芥和过量表达AtNHXS1的拟南芥生长状况明显优于野生型拟南芥，且过量表达AtNHXS1的拟南芥的生长状况在一定程度上优于过量表达AtNHX1的拟南芥，其干重、鲜重显著高于后者，且其地上部分Na+、K+和脯氨酸含量高于后者。
　　 总结以上研究结果，通过DNA改组技术结合酵母表达系统对植物Na+/H+antiporter进行定向分子进化和筛选，获得了一个新的强耐盐基因AtNHXS1，该基因表达的蛋白在酵母中仍然定位于液泡，且具有更强的Na+转运活性，表达此基因的酵母能富集更多的Na+和K+，因而具有更强的耐盐性。过量表达该基因的转基因拟南芥的耐盐能力也较转入野生型AtNHX1基因的拟南芥在一定程度上得到提升。本研究为进一步理解AtNHX1结构与功能的关系提供了新的信息，同时得到的新的强耐盐基因可应用于培育强耐盐转基因植物的分子育种。