基于中华绒螯蟹EST序列的深度发掘-免疫和营养相关基因的克隆与表达研究

摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的水产经济养殖品种，目前以形成了庞大的产业，创造了可观的经济利润和社会效益。但随着中华绒螯蟹养殖业的发展，各种疾病频发，严重制约了产业的可持续发展。由于中华绒螯蟹在内的甲壳动物不具备适应性免疫而仅具有先天免疫，所以探明先天免疫相关基因的作用机制对于阐明甲壳动物的先天免疫应答步骤和机理，解决生产中碰到的疾病问题有深远的意义。除了病害，饲料也是制约中华绒螯蟹产业发展的重要因素。由于目前国际鱼粉价格的居高不下，饲料成本逐渐增加，提高中华绒螯蟹对饲料营养物质的利用效率可为缓解当前饲料成本居高的想象提供有效手段，而随着饲料营养物质利用效率的提高，养殖业对水体环境的污染也降低，这又在另一方面促进了产业的可持续发展。鉴于以上原因，本论文克隆得到了中华绒螯蟹组织蛋白酶L(catL)，组织蛋白酶C(catC)，组织蛋白酶A(catA)，巨噬细胞游走抑制因子(MIF)和脂肪酸结合蛋白(FABP)基因，分析了其在中华绒螯蟹不同组织中的表达情况，并研究了病原微生物感染后免疫相关基因的表达模式，精巢快速发育期营养相关基因的的表达模式和微量元素锌对其影响。
　　 1.组织蛋白酶L的基因克隆及其表达分析
　　 组织蛋白酶家族是广泛存在与机体各组织中的一类基因，他们在机体的免疫能力、对营养物质的消化利用等方面都发挥了重要作用。中华绒螯蟹catL的cDNA全长1274 bp，其中包括编码325个氨基酸残基的长为978 bp的开放阅读框。与其他物种catL的氨基酸比对分析发现中华绒螯蟹具有该家族基因所共有的基序。基因的时空表达分析表明，catL基因在各组织中广泛表达，其中在肝胰腺、鳃、胃和血细胞中的表达量最高。当中华绒螯蟹经鳗弧菌感染后发现，catL基因的mRNA表达量与酶活都在攻毒后8小时达到最高。上述研究证实catL参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。
　　 2.组织蛋白酶C的基因克隆及其表达分析
　　 中华绒螯蟹catC的cDNA全长1481 bp，其中包括编码427个氨基酸残基的长为1284 bp的开放阅读框。与其他物种catC的氨基酸比对分析发现中华绒螯
　　 蟹catC的蛋白质序列与其他物种有较高的相似度。当中华绒螯蟹经鳗弧菌感染后发现，catC基因的mRNA表达量在攻毒后6小时达到最高。上述研究证实catC参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。
　　 3.组织蛋白酶A的基因克隆及其表达分析
　　 中华绒螯蟹catA的cDNA全长2200 bp，其中包括编码465个氨基酸残基的长为1398 bp的开放阅读框。与其他物种catA的氨基酸比对分析发现中华绒螯蟹catA的蛋白质序列与其他脊椎动物的相似度为48％到51％。CatA的时空表达分析表明该基因具有组织依赖性，并且在鳃中的表达量最高。当中华绒螯蟹经鳗弧菌感染后发现，catA基因的mRNA表达量在攻毒后12小时达到最高。上述研究证实catA参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。
　　 4.巨噬细胞游走抑制因子的基因克隆及其表达分析
　　 MIF作为一种多功能的细胞因子在先天免疫和后天免疫的应答过程中都有重要作用，但其在甲壳动物先天免疫中的作用机制仍不明。因此我们克隆得到了了中华绒螯蟹的MIF基因，并对其组织表达和免疫功能进行了分析。结果表明，中华绒螯蟹MIF的cDNA全长704 bp，其中包括编码120个氨基酸残基的长为363bp的开放阅读框。与其他物种catA的氨基酸比对分析发现中华绒螯蟹具有该基因所共有的活化位点。MIF的时空表达分析表明该基因具有组织特异性，并且在肝胰腺中的表达量最高。当中华绒螯蟹经鳗弧菌感染后发现，catA基因在血淋巴中的mRNA表达量在攻毒后8小时达到最高，在肝胰腺和鳃中的表达量均在攻毒后12小时达到最高。上述研究证实MIF参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。
　　 5.脂肪酸结合蛋白基因克隆及其在精巢快速发育期不同组织的表达分析
　　 FABP是一类对于机体脂肪酸运输和代谢有重要作用的蛋白，其功能在脊椎动物中已被广泛研究，但在无脊椎动物，特别是甲壳动物中的研究极少。因此我们克隆得到了了中华绒螯蟹的FABP基因，并对其组织表达和在精巢快速发育期不同组织的表达变化进行了分析。结果表明，中华绒螯蟹FABP的cDNA全长898bp，其中包括编码136个氨基酸残基的长为411bp的开放阅读框。与其他物种FABP的氨基酸比对分析发现中华绒螯蟹具有该基因所共有的签名序列。FABP的时空表达分析表明该基因在中华绒螯蟹各组织中广泛表达，并且在肠、卵巢、精巢和心脏中的表达量最高。对处于精巢快速发育期的中华绒螯蟹的FABP基因表达量的分析表明，各组织中FABP的表达量都依赖于精巢的发育阶段。研究证明了FABP在中华绒螯蟹精巢快速发育阶段脂肪酸运输和代谢过程中的重要作用，并间接证明了肝胰腺、精巢、卵巢和血细胞在脂肪酸运输过程中的相互作用。
　　 6.饲料锌对中华绒螯蟹生长、肝胰腺脂肪酸组成和相关基因表达的影响
　　 锌是一类具有多功能的微量元素，与机体内很多含锌酶和依赖锌的酶有重要的相互作用，是中华绒螯蟹的必需营养元素，对于中华绒螯蟹的免疫能力和营养物质代谢能力有重要的作用。为了全面衡量饲料锌浓度对中华绒螯蟹生长、免疫能力和营养物质代谢能力的影响，本实验设计了5个浓度梯度的含锌饲料(0，10，20，40 and80 mg/kg饲料)对中华绒螯蟹饲养8周后测定了相关指标。结果表明，当饲料锌添加量为20mg Zn/kg饲料，饲料锌实测浓度为27 mg Zn/kg饲料时中华绒螯蟹有最大体增重率。肝胰腺的锌浓度随着饲料锌添加量的增加而提高。肝胰腺的脂肪酸组成随着饲料锌浓度的提高而变化。随着饲料锌浓度的增加，18:0的组成呈下降趋势，而8:1 n-9，18:3 n-3，20:4 n-6(ARA)和22:6 n-3(DHA)的组成呈钟形变化趋势。FABP和金属硫蛋白(MT-1)的表达量分别在饲料锌浓度为27 mg Zn/kg饲料和44 mg Zn/kg饲料时达到最高。