过量表达改组后AtNHX1基因显著提高了水稻、烟草的耐盐性

摘要

盐胁迫是影响植物生长分布、产量和质量的主要非生物胁迫因素之一。土壤盐渍化严重影响了植物尤其是灌溉农业作物的产量，应用基因工程手段转化耐盐相关基因到盐敏感的植物中进而改良植物的耐盐性，将成为解决这个问题的有效途径。
　　 盐胁迫主要是由Na+离子引起的。植物通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter)将Na+区隔化到液泡中，一方面可以降低胞质Na+浓度，另一方面还可以促进细胞吸水起到渗透调节的作用，是一种经济有效的维持Na+均衡的方式。植物液泡膜Na+/H+antiporter对植物耐盐起着非常重要的作用。然而，在实际生产应用上，目前在植物中已克隆的Na+/H+antiporter基因耐盐性不强，这很大程度上限制了该基因在作物分子育种中的应用。
　　 自1994年首次提出至今，DNA改组(DNA shuffling)技术已经成为基因定向进化最为有效的方法之一。本实验室在以前的研究中以拟南芥AtNHX1基因为模板，结合DNA Shuffling和酵母中异源表达改组基因文库技术，筛选获得活性显著提高、盐耐受性显著提高的新Na+/H+antiporter基因AtNHXS1。酵母功能互补试验显示，AtNHXS1表达的Na+/H+逆向转运蛋白较AtNHX1基因的表达产物耐NaCl能力提高了一倍。在本项研究中，我们将改组后的AtNHX1转化到水稻和烟草中，分析过量表达AtNHXS1对转基因水稻和烟草耐盐性的影响。
　　 本研究构建了植物表达载体pCAMBIA1301-35SN-AtNHXS1，并通过冻融法转入农杆菌EHA105中，以水稻(中花-11号)的成熟胚为外植体，通过农杆菌介导法将AtNHXS1转入水稻，经过潮霉素筛选和PCR鉴定初步获得了21个转基因植株。选择T1代种子较多的6个转基因水稻株系进行GUS染色，确定各株GUS染色比均符合遗传学分离比3:1，选择其中两个符合分离比的转基因水稻植株作为Southern blot检测的材料，确定AtNHXS1以单拷贝的形式插入到基因组中。利用Real-Time PCR技术检测分析盐处理前后AtNHXS1在转录水平上的表达变化情况。在正常生长状态下，AtNHXS1在转基因水稻中过量表达。用100mM、150mM NaCl盐溶液对转基因水稻处理3天后，AtNHXS1在盐处理后表达有上调，分别比0mM NaCl处理下提高了1.46倍、2.49倍。在相同盐胁迫下，转基因水稻的生长情况明显优于野生型，300mM NaCl处理5天后，野生型水稻全部死亡，但转基因水稻只是生长受到抑制，撤去盐胁迫后10天内可以恢复生长。比较野生型和转基因水稻在正常生长状态和盐胁迫条件下的干重、鲜重、Na+、K+的指标变化，分析结果表明，正常生长状态下，两者没有显著变化，而在盐胁迫下，转基因水稻的干重、鲜重、Na+含量明显高于野生型，K+离子含量略低于对照。
　　 此外，为进一步证实AtNHXS1提高植物耐盐性的效果，我们还通过农杆菌介导法对烟草(革新1号)进行遗传转化，经PCR检测确定得到10个转基因株系，随机挑选其中两个株系进行Southern blot检测，确定AtNHXS1以单拷贝的形式插入烟草基因组中。Real-Time PCR检测表明AtNHXS1在转基因烟草中过量表达，通过分析转基因烟草在不同盐浓度处理不同组织中的表达情况，发现AtNHXS1的表达量在叶中最多、根中其次、茎中最少，并且随着盐浓度的提高表达量有相应的上调。耐盐性试验结果表明，盐处理下，转基因烟草的长势明显优于野生型。在400mM NaCl处理下，野生型烟草完全死亡，转基因烟草生长受到抑制，但是仍然能够正常生长。
　　 上述实验结果均表明，改组后AtNHXS1新基因能够显著提高水稻、烟草的耐盐性，有望应用于植物耐盐分子育种。