埃他卡林对重要器官心脑肝基因表达的影响

摘要

埃他卡林(iptakalim，Ipt)是军事医学科学院毒物药物研究所自行合成的一类具有新化学结构类型的抗高血压药物，具有开放ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATP)引起血压降低的新型药理学作用机制。在治疗学方面，埃他卡林降压作用平稳、持续时间长，对心率的影响轻，同时埃他卡林具有逆转高血压心血管重构的作用，对高血压所引起脑损害、肾损害均有保护作用，是一类具有临床应用前景的抗高血压药物。本研究室前期工作对该化合物的作用机制、作用特点以及药物作用谱已有广泛深入的研究，但是该化合物作用后对体内重要的基因和蛋白有何影响目前尚不清楚，而认识该问题对于我们全面理解埃他卡林的疗效以及预测不良反应具有重要意义。 基因芯片技术具有高通量、快速、高效、平行性和全面等特点，能全面阐述药物在体内的生物学特点，为全面研究药物的疗效以及不良反应提供了技术平台。因此本实验采用基因芯片技术，观察埃他卡林对重要器官心、肝和脑组织在基因表达水平的影响，初步判断埃他卡林的基因作用谱，为进一步阐述埃他卡林的体内生物学作用特征提供实验依据。同时本实验以心脏组织为重点，从功能上观察埃他卡林用药对心功能的影响，为评价长期服药安全性提供实验依据。一、埃他卡林对大鼠心脏组织基因表达的影响1.埃他卡林对大鼠心脏组织差异表达的基因采用的BioStarR40scDNA芯片涵盖大鼠基因组中4096个具有重要功能的基因序列，检测经埃他卡林3mg/kgpo2周处理后的大鼠心脏组织基因表达的变化。结果表明，心脏组织差异表达的基因共有236条，其中100个基因表达上调，136个基因表达下调。埃他卡林调节心脏组织的基因表达包括与肌肉收缩相关的肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白等；与信号转导相关的G蛋白、腺苷酸环化酶和钙调结合蛋白等。 2.反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法验证心脏差异表达基因采用RT-PCR技术，选取部分上述差异表达的基因对芯片实验结果进行验证，结果表明：肌球蛋白调控轻链、ADP-核糖基因子1、ADP-核糖基因子4、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(Gs)、腺苷酸环化酶(AC)表达增加，蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白磷酸酶2基因表达减少，与芯片结果一致。 3.埃他卡林对大鼠心脏蛋白激酶A(PKA)活性的影响采用非放射性标记方法检测蛋白激酶A的活性，发现埃他卡林可使PKA的活性升高76％(P＜0.05)。 4.埃他卡林对麻醉大鼠血流动力学的影响Wistar雄性大鼠随机分为5组：正常对照组(生理盐水组)，埃他卡林1、3和9mg/kg组，第5组给埃他卡林9mg/kg但用药结束后停药10天(9mg/kg撤药组)。灌胃，两周。观察最后一次给药24小时后麻醉大鼠血流动力学的改变。 采用直接插管法，观测麻醉大鼠的血压(SBP、DBP、MAP)、心率(HR)和收缩功能参数(LVSP、+dp/dtmax、Vpm)以及舒张功能参数(-dp/dtmax、-dp/dtmaxTime)指标的变化。结果表明，埃他卡林1、3、9mg/kg组及9mg/kg撤药组对心率、收缩压、舒张压以及平均动脉压、收缩功能及舒张功能均无明显影响(P＞0.05)。 5.埃他卡林对大鼠离体工作心脏功能的影响离体工作心脏因不受神经、体液及外周阻力等调节因素的影响，可用于研究药物对心脏的直接作用，本实验灌胃给予埃他卡林2周，在最后一次给药24小时后取其心脏，分别观察其对正性肌力药异丙肾上腺素(Iso)及负性肌力药吡那地尔(Pin)的反应。 实验结果表明异丙肾上腺素10nmol/L具有正性频率以及正性肌力的作用，埃他卡林1、3、9mg/kg组及9mg/kg撤药组的离体工作心脏，对异丙肾上腺素(10nmol/L)灌流10min的反应特征一致，即与正常对照组相比，对各心功能指标均无显著的影响。吡那地尔10μmol/L具有正性频率以及负性肌力的作用。埃他卡林1、3、9mg/kg组及9mg/kg撤药组的离体工作心脏，对吡那地尔(10μmol/L)灌流10min的反应特征一致，即与正常对照组相比，对各心功能指标均无显著的影响。结果提示心肌对肾上腺素受体激动剂(异丙肾上腺素)和钾通道开放剂(吡那地尔)的心脏药理学反应无显著变化。 6.埃他卡林对心脏组织形态学和超微结构的影响从组织形态学和超微结构观察埃他卡林对大鼠心肌组织的影响，结果表明，埃他卡林1、3、9mg/kg组及9mg/kg撤药组对大鼠心肌组织学无病理学意义的变化，即心肌纤维排列整齐、致密；埃他卡林1、3、9mg/kg组及9mg/kg撤药组对大鼠心肌超微结构无病理学意义的变化，即肌纤维排列规整，线粒体结构完整。 二、埃他卡林对大鼠肝脏组织基因表达的影响采用BioStarR40scDNA芯片检测经埃他卡林3mg/kg2周处理后的大鼠肝脏组织基因表达的变化，肝脏组织发现6个表达差异的基因，表达均上调，包括CYP4a10、CYPgb1、肉碱棕榈酰转移酶、烯酰CoA水化酶、EST197129、n0002e06。采用RT-PCR方法对部分结果进行验证，发现CYP4a10、CYP8b1、烯酰CoA水化酶表达上调，与芯片结果一致。 三、埃他卡林对大鼠脑组织基因表达的影响采用BioStarR40scDNA芯片检测经埃他卡林3mg/kg2周处理后的大鼠脑组织基因表达的变化，芯片结果表明：该实验体系下埃他卡林对正常脑组织基因表达无影响。 综上所述，本研究结论如下：1.全新结构的化合物埃他卡林对重要器官心、脑和肝脏基因表达的调节作用具有选择性。采用4096个具有重要功能的基因序列的芯片，埃他卡林3mg/kgpo2周，大鼠心脏236个基因的表达发生变化，其中100个基因表达上调，136个基因表达下调；肝脏6个基因表达上调；脑组织的基因表达未发生变化。 2.埃他卡林调节心脏组织的基因表达包括与肌肉收缩相关的肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白等；与信号转导相关的G蛋白、腺苷酸环化酶和钙调结合蛋白等。 3.反复给予埃他卡林可增加心肌PKA活性。 4.埃他卡林1、3、9mg/kgpo2周，最后一次给药24小时后，在体心脏功能未发现有药理学意义的变化；也未发现心肌组织及其超微结构有病理学意义的变化；心肌对肾上腺素受体激动剂(异丙肾上腺素)和钾通道开放剂(吡那地尔)的心脏药理学反应也无显著变化，未发现反复给予埃他卡林对心脏的不良反应。埃他卡林对心脏基因表达的调节作用与其心脏药理学作用之间的关系有待进一步研究。

目录

缩写与略语

前言

实验材料

实验方法

一、动物模型与分组

二、BioStarR-40S cDNA表达谱芯片的制备

三、基因芯片检测埃他卡林对大鼠重要器官心脑肝基因的差异表达

四、RT-PCR

五、蛋白激酶A(PKA)活性的测定

六、大鼠动脉血压及心功能指标的测定

七、大鼠离体工作心脏功能指标的测定

八、心肌组织形态和超微结构的观察

九、数据处理

实验结果

第一章埃他卡林对大鼠心脏组织基因表达的影响

四、埃他卡林对麻醉大鼠血流动力学的影响

五、埃他卡林对大鼠离体工作心脏功能的影响

六、 埃他卡林对大鼠心脏组织形态学及超微结构的影响

结语

第二章埃他卡林对大鼠肝脏组织基因表达的影响

一、埃他卡林对大鼠肝脏组织基因表达谱的影响

二、RT-PCR方法验证肝脏组织差异表达基因

结语

第三章埃他卡林对大鼠脑组织基因表达的影响

(一)BiostarR40s型大鼠基因芯片杂交结果及杂交体系的认证

结语

讨论

一、埃他卡林对心脏基因表达和功能的影响

1.基因表达改变谱的分析

2.心脏功能分析

二、埃他卡林对肝脏基因表达的影响

三、埃他卡林对脑组织基因表达的影响

全文总结

参考文献

文献综述 药物靶标研究中的功能基因组学

个人简历

致谢