低氧预适应增强大鼠海马神经元缺氧耐受性与Mito-K作用机制的研究

摘要

低氧预适应(Hypoxicpreconditioning，PC)是指用非致死性低浓度氧，通过反复暂短刺激使机体器官、组织和细胞对随后更严重缺氧产生耐受性，从而产生重要的保护作用，它是机体特有的内源性保护现象。有关低氧预适应产生保护机制的研究已涉及众多方面，包括酶、活性氧、受体、递质、抗凋亡物质及离子通道等。尽管有相关多篇文献报道，但关于低氧预适应的确切机制仍为阐明，并且有的还存在着严重的争议，另外，关于低氧预适应产生的保护作用对临床中脑缺氧、缺血和其他脑血管疾病，以及对高原、高山、航空、航天和潜水等特殊环境中脑损害的治疗有着直接的意义，所以，脑低氧预适应产生的保护作用机制的研究，无论在基础领域还是在临床实践应用范围，都有重要的研究价值。 低氧预适应现象最早于1986年由Schurr等[1]在大鼠海马脑片上发现，迄今近二十年的历史，在低氧预适应产生脑保护作用机制的研究中，其中ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannels，KATP)无论是从1983年后由Noma等[2]在心肌细胞膜上首次发现已来，还是到1991年Inoue等[3]在线粒体内膜发现以后，一直是脑低氧预适应机制研究中的一个焦点。但是，2000年以前众多研究者的目光多注重在细胞膜上的KATP，并且已有相关文献报道[4-6]。线粒体内膜KATP直到1997年后才引起人们的注意，Garlid等[10]在研究心肌细胞缺氧/缺血保护时，发现与过去利用KATP激动剂二氮嗪能缩短心肌细胞动作电位时程对心肌有保护作用的结论相矛盾的现象，实验者利用低浓度的二氮嗪(毫摩尔水平)时，对心肌缺氧/缺血有保护作用，但对心肌细胞的动作电位时程无影响，提出低浓度的二氮嗪不是作用在胞膜上KATP，而是通过线粒体内膜KATP对心肌起保护作用。2002年N.rajapakse等[1]首次报道了脑线粒体KATP(mitochondriaATP-sensitivepotassiumchannels，mito-KATP)对新生大鼠脑缺氧/缺血有保护作用。2003年Taikk等[12]首次报道激活mito-KATP，能对抗鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用。但脑低氧预适应产生的保护机制与线粒体KATP的之间关系的研究结果至今未见报道。海马神经元对缺氧和缺血非常敏感的特点，一直被用来作为研究缺血和缺氧的主要模型。基于以上原因，本工作旨在利用大鼠海马神经元低氧预处理模型，研究线粒体内膜KATP在低氧预适应保护机制的作用。 本工作包括以下几个方面：1从成年大鼠整体水平到培养成熟海马神经元单个细胞水平上，建立低氧预适应模型，进行研究低氧预适应对再次急性缺氧的耐受性。 其中研究海马神经细胞耐缺氧指标包括：①在整体水平制备好低氧预适应模型后，立即制成离体的海马切片，在海马脑片中对缺氧最为敏感的CA1的椎体神经元，进行膜片钳全细胞记录模式记录，再对脑片进行缺氧，利用超极化电位、膜电位去极化水平及记录神经元存活等指标研究低氧预适应组海马神经元是否比对照组有明显的耐缺氧能力。 ②在培养成熟的海马神经元单个细胞水平上研究低氧预适应对再次急性缺氧的产生的耐受性，具体通过计算急性缺氧后两组神经元的存活率。 ③通过动态观察急性缺氧过程中细胞内钙荧光的变化，来反映细胞内钙离子稳定情况作为判断细胞对耐缺氧能力的一个指标。 ④通过动态观察急性缺氧过程中细胞内罗丹明荧光的变化，来反映细胞内线粒体膜电位稳定情况作为判断细胞对耐缺氧能力的又一个指标。 通过上述四部分内容证明了低氧预适应后，海马神经元对再次急性缺氧有明显的耐受性。实验结果表现为：a低氧预适应组的海马脑片在急性缺氧过程中存活时间明显比对照组长。 b低氧预适应组的海马神经元急性缺氧后，细胞存活率明显高于对照组。 c低氧预适应组的海马神经元在急性缺氧过程中细胞内钙离子浓度比对照组明显稳定。 d低氧预适应组的海马神经元在急性缺氧过程中，线粒体膜电位比对照组明显稳定。 2利用线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂和细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂，对上述低氧预适应产生的耐缺氧能力进行特异性阻断，以来判定低氧预适应产生的保护作用，具体是通过哪种ATP敏感性钾通道产生。 利用两种特异性阻断剂对上述低氧预适应产生的耐缺氧能力干预的研究结果表明：a线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂5-DH能明显缩短低氧预适应组的海马脑片在急性缺氧过程中存活时间。 b线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂5-DH明显降低预适应组的海马神经元急性缺氧后的细胞存活率。 c线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂5-DH明显降低预适应组的海马神经元在急性缺氧过程中细胞内钙离子浓度的稳定性。 d线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂5-DH明显降低预适应组的海马神经元在急性缺氧过程中的线粒体膜电位稳定性。 但应用细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂tolbutamide对上述变化没有明显的影响。 3利用westernblot蛋白印记分析抗细胞凋亡蛋白bcl-2表达。同时运用两种特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂，以分析低氧预适应产生的保护作用是否与凋亡途径相关，以及这种相关性是否与ATP敏感性钾通道有联系。 实验结果表明，低氧预适应组的bcl-2表达量比对照组有所增加，事先运用线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂和细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂后，加入线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂5-HD能减低低氧预适应组的bcl-2表达量，而应用细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂tolbutamide后，对低氧预适应组的bcl-2表达量没有明显变化。 小结：本工作先后在成年大鼠整体水平和培养成熟的单个海马神经元的细胞水平上进行了低氧预适应的模型制备，利用了海马脑片的膜片钳全细胞记录技术方法、细胞记数计算神经元存活率方法、荧光共聚焦动态检测急性缺氧过程中的海马神经元细胞内钙离子和线粒体膜电位稳定的技术方法及westernblot蛋白印记分析技术方法，对低氧预适应组海马神经元对再次急性缺氧产生的耐受性进行了研究，又利用线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂和细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂对上述作用的干涉研究，发现低氧预适应的海马神经元对再次急性缺氧有明显的耐受性，并且该作用可被线粒体内膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂明显降低，但细胞膜特异性的ATP敏感性钾通道阻断剂没有明显作用。得出结论：低氧预适应产生保护作用机制与线粒体ATP敏感性钾通道的关系更为重要，而与细胞膜ATP敏感性钾通道无明显关系。另外，本工作也是首次在成年大鼠海马切片，利用膜片钳技术得出低氧预适应能使海马神经细胞的耐缺氧能力增强的实验结果，并且证明该机制与线粒体ATP敏感性钾通道有明显关系。

目录

缩略语表

前言

材料与方法

1大鼠低氧预适应模型制备

2离体海马脑片制备

3海马脑片膜片钳全细胞记录

4海马神经元原代培养

5培养海马神经元的低氧预适应实验

6海马神经细胞急性缺氧和台盼蓝染色方法

7激光共聚焦显微镜动态观测细胞在急性缺氧下游离钙变化

8荧光共聚焦显微镜动态观测细胞在急性缺氧下线粒体膜电位变化

9 Western Blot免疫印记

结果

1低氧预适应增强海马神经元缺氧耐受性的电生理结果

2低氧预适应对海马神经元急性缺氧后存活率的影响

3低氧预适应对海马神经元急性缺氧后细胞内游离钙的影响

4低氧预适应对海马神经元急性缺氧后细胞线粒体膜电位的影响

5低氧预适应对海马神经元bcl-2表达的影响

讨论

1低氧预适应增强海马神经元缺氧耐受性

2低氧预适应增强海马神经元耐缺氧能力机制讨论

3低氧预适应对Bcl-2表达的影响

小结

参考文献

文献综述：线粒体ATP敏感性钾通道：脑缺氧/缺血预适应保护的新焦点

线粒体内膜KATP阻断剂能取消低氧预适应产生的脑保护作用

博士期间著作和会议摘要

致谢