应用RNA干涉抑制肺癌细胞高表达的DNA甲基转移酶1（DNMT1）的研究

摘要

本研究应用RNAi技术敲降肿瘤细胞中异常高表达的DNA甲基转移酶1(DNMT1)，并观察肿瘤细胞恶性表型的变化，以期探讨DNMT1与抑癌基因异常甲基化等肿瘤恶性表型之间的关系，以及DNMT1在肿瘤发生发展中的作用，进而讨论以DNMT1作为RNAi治疗肿瘤靶标的应用前景。 首先采用MSP、COBRA等DNA甲基化检测技术，RT-PCR、Real-timePCR和Westernblot等基因表达检测技术筛选获得DNMT1高表达而抑癌基因RASSF1A异常甲基化失活的细胞系NCI-H157(非小细胞肺腺癌)。以该细胞系作为RNAi敲降DNMT1的体外细胞模型，应用RT-PCR、荧光定量PCR等技术，筛选获得两个有效的RNAi靶位，分别为SD1和SD5。SD1敲降DNMT1的表达后，RAFF1A表达得以恢复，同时，NCI-H157的增殖受到抑制。流式分析结果显示，SD1能够诱导NCI-H157G1期阻滞。为获得稳定敲降DNMT1的细胞系，本研究着手建立了四环素诱导型shRNA表达系统，通过共转染报告基因Luciferases表达载体筛选获得了高表达四环素抑制子TR的pcDNA6TR稳定转染株，并构建了分别表达SD1和SD5的重组表达载体pTER+-shRNA(SD1)和pTER+-shRNA(SD5)。 上述结果表明，肿瘤细胞中DNMT1的高表达是导致抑癌基因异常甲基化的重要原因，敲降DNMT1表达，能够在一定程度上逆转肿瘤的恶性表型。探讨和阐明DNMT1在肿瘤发生发展中的作用不仅是重要的基础研究课题，对于临床治疗也具有重要意义。 本研究检测了NCI-H157细胞中抑癌基因RASSF1A、p16基因调控区CpG岛的甲基化情况，以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达，结果显示p16启动子区CpG岛并未甲基化，而且有表达，这与文献报道不符，可能原因是细胞系在传代过程中发生了变异。本研究首次以非小细胞肺腺癌细胞NCI-H157为细胞模型，应用RNAi敲降高表达的DNMT1，并证明随着DNMT1表达下调，RAFF1A恢复表达，细胞增殖受到抑制，其机制可能是诱导细胞G1期阻滞。

目录

摘要

引 言

第一部分细胞模型的建立

一.多种肿瘤细胞系抑癌基因的甲基化检测

二.确立人非小细胞肺癌NCI-H157为实验细胞系

讨论

小结

第二部分RNAi敲降DNA甲基转移酶1(DNMT1)

一.RNAi敲降DNMT1的表达

讨论

小结

第三部分诱导型shRNA表达系统的建立

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

结论

参考文献

附录Ⅰ主要溶液的配制

附录Ⅱ主要缩略语表

发表论文RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1（DNMT1）的表达

文献综述DNA甲基转移酶1（DNMT1）——肿瘤发生发展中的重要基因

致谢