基于计算机辅助分子设计的抗CD20单克隆抗体的改造

摘要

鼠源单克隆抗体在临床应用中有以下缺点：诱发人体产生人抗小鼠抗体(humananti-mounseantibody,HAMA)反应，在人体内半寿期短，不能够有效地激活人体的生物效应功能，如补体依赖的细胞毒作用(complement-dependentcytotoxicity,CDC)及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)。通过分子生物学技术对鼠抗体进行人源化改造在一定程度上可以克服这些缺点。本室制备的鼠源抗CD20单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)1-28具有潜在的应用价值。本研究在对mAb1-28(简称1-28)功能进行验证的基础上，通过计算机辅助分子设计和分子生物学技术对其进行改造，构建了抗CD20嵌合抗体C1-28和新型小分子抗CD20抗体5S(scFv-Fc)，并对其抗原结合特性及通过CDC杀伤肿瘤细胞的功能进行了初步研究。 1抗CD20单克隆抗体1-28的免疫学特性及功能分析首先分析了1-28与靶细胞的结合活性。间接免疫荧光的结果显示，1-28可与人B细胞淋巴瘤Daudi细胞和Raji细胞结合，而不与人T细胞系Jurkat细胞结合，表明1-28与靶细胞的结合是特异的。流式细胞术分析结果显示，1-28与Daudi和Raji细胞结合的阳性率达99％以上。相对亲和力(relativebindingaffinity)测试结果显示，1-28的亲和力为美罗华亲和力的1/12左右。通过ELISA法测定出1-28的亲和常数为K=1.6×1010M-1。竞争实验的结果提示1-28与另外两种抗CD20抗体(美罗华、2H7)识别的是不同的抗原表位。1-28对Raji细胞和Daudi细胞都具有生长抑制效应，但是程度不同。另外，1-28可以诱导Raji细胞和Daudi细胞发生凋亡。1-28还可通过激活补体杀伤靶细胞。以Raji细胞为研究对象时，其半数杀伤浓度为1.26nmol/L。1-28对非靶细胞Jurkat没有CDC的功能，提示这种杀伤是特异的。 22抗CD20嵌合抗体的构建、表达及免疫学特性分析采用RT-PCR，从分泌抗CD20抗体的杂交瘤细胞系中钓取1-28抗体的轻、重链基因。为了确定钓取的基因是功能性1-28抗体基因，将1-28抗体轻重链用蛋白电泳分离后，通过质谱测定1-28轻链及重链部分蛋白序列。经对比所测DNA序列与蛋白序列，确定了所钓取基因的正确性。为在以后的研究中有一个阳性对照，我们全合成了已知抗CD20抗体2H7的可变区基因。将1-28可变区基因及2H7的可变区基因连接至表达载体pCMV-VH和pCMV-VL中，分别构建成1-28的嵌合抗体真核表达载体(C1-28H和C1-28L)及2H7的嵌合抗体真核表达载体(C2H7H和C2H7L)。脂质体介导法将嵌合抗体的表达载体转染入293T细胞，实现了目的蛋白在真核细胞中高水平表达。C1-28的表达量为210μg/mL，C2H7的表达量为262μg/mL。SDS-PAGE的检测结果进一步确认了所表达蛋白的分子大小是150kDa。在后续的免疫学特性分析的过程中，发现C1-28丧失了亲本抗体与靶细胞的结合活性，而C2H7却很好地保留了结合活性。CDC的实验结果表明，C2H7可以激活兔补体，也可以激活人补体特异性地杀伤靶细胞。 3新型小分子抗体5S的设计、构建及免疫学功能检测利用同源模建原理，借助http：//www.expasy.ch对1-28可变区基因的空间结构进行了理论模拟。根据分子间氢键形成理论、反应自由能理论对抗体1-28可变区基因形成的Fv稳定性进行探讨。结果表明，由于1-28轻、重链空间构象的结构匹配性、静电互补性较差，形成的复合物Fv稳定性弱，导致其生物活性低。因此，在轻重链V区间引入(Gly4Ser)3Linker，构建VH-Linker-VL单链抗体scFv。经三维结构分析，提示Linker的引入，并不改变抗体的活性区域构象特点，提高了抗体的稳定性。 根据计算机辅助分子设计的结果，我们设计了编码(Gly4Ser)3的碱基序列，置于VH和VL之间，完成了5S(scFv-Fc)表达载体的构建，并在真核细胞中获得了58μg/mL的表达水平。SDS-PAGE的结果显示，5S在上清中多以10kDa(二聚体)的形式存在，部分以5kDa(单体)的形式存在，没有发现多聚体的存在。间接免疫荧光结果显示，5S可以很好的与靶细胞结合，结合阳性率达99％左右，但不能够与Jurkat细胞结合，提示这种结合是特异的。由于具有人IgG1的Fc段，5S可通过激活补体杀伤Daudi细胞，半数杀伤浓度为7.4μg/mL，而对Jurkat细胞没有作用，提示这种杀伤作用是特异的。

目录

英文缩写及中英文对照

前言

第一部分抗CD20单克隆抗体1-28的功能鉴定

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

第二部分嵌合抗体C1-28和C2H7的构建、表达及功能检测

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三部分新型小分子抗体5S的设计、构建及免疫学功能检测

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

总结

参考文献

致谢

附录1文献综述

附录2博士期间发表及待发表的文章目录