利用条件基因剔除技术研究Smad4基因在心脏发育与疾病中的功能

摘要

转化生长因子-β(TGF-β)超家族分子在调节细胞增殖、谱系分化、迁移、黏附和凋亡过程中具有重要作用。Smad4分子是TGF-β超家族分子信号通路的中心介导者。为了进一步深入研究TGF-β超家族分子在心脏发生发育和疾病过程中的功能，我们利用Cre-loxP系统研制了心肌细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。 我们建立了在心脏组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠(α-MHC-Cre)。对Cre重组酶在转基因小鼠中的组织分布及其在体内介导基因重组作用进行了研究，发现该转基因小鼠只在心肌细胞中特异性表达Cre重组酶，并在体内成功地介导心肌细胞基因组上LoxP位点间的重组，可作为在心肌细胞进行基因剔除的工具小鼠。 将心肌细胞特异性Cre转基因小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠杂交，获得了心肌细胞特异性Smad4基因剔除小鼠。Smad4基因剔除小鼠无胚胎致死性，大约70％的基因剔除小鼠在5-12月龄死亡。Smad4基因剔除小鼠在1月龄开始出现心肌肥厚，其心脏与体重(HW/BW)、心脏与胫骨长度(HW/TL)的比值较对照小鼠明显升高，MHCβ，ANF,BNP等心肌肥厚的标志性分子在突变小鼠心肌中的表达水平也显著上调。组织学分析以及分离成年小鼠心肌细胞测量结果显示Smad4基因剔除小鼠的心肌细胞尺寸明显增加。Smad4基因剔除小鼠心脏随年龄增长可出现明显纤维化，电镜检测结果显示心肌线粒体的损伤和心肌纤维Z带排列紊乱等病理改变。利用M型超声和颈动脉插管检测了小鼠的心脏功能和血流动力学变化，发现Smad4基因突变导致小鼠心脏收缩功能受损。为了研究心肌肥厚形成的分子机制，我们还检测了突变小鼠心脏中MAPK和PI3K等心肌肥厚相关信号通路中重要分子的表达，发现MEK1-ERK1/2通路被激活可能是导致Smad4突变小鼠心肌肥厚的原因之一。 我们的实验结果首次提供体内的遗传学证据证明Smad4分子在心室重塑过程中的重要作用。首次提出心肌细胞对TGF-β分子反应性的改变可能是引起心肌肥厚的一种机制。心肌细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的成功研制为深入研究相关心脏疾病的发病机制以及新药筛选和药效评价提供了较理想的动物模型。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1 TGF-β家族分子在心脏发育中的重要作用

1.1.1 TGF-β分子促进心脏前体细胞的特化

1.1.2环状心的正常形成需要TGF-β分子参与

1.1.3 TGF-β分子促进心内膜的表皮向间充质的转化和心脏瓣膜的形成

1.1.4 TGF-β分子与先天性心脏疾病

1.2 TGF-β信号通路的变化引起心脏的病理改变

1.2.1 TGF-β可促使心肌肥厚以及其向心衰的转变

1.2.2 TGF-β可以促进心脏的纤维化改变

1.2.3 TGF-β与其他心脏病理

1.3研究的目的和意义

1.4研究的初步结果

2.1材料和方法

2.1.1工具酶与试剂

2.1.2菌株和载体

2.1.3实验动物

2.1.4转基因载体α-MHC-Cre的构建及鉴定

2.1.5受精卵的显微注射

2.1.6小鼠基因组DNA的制备

2.1.7α-MHC-Cre转基因小鼠的基因型鉴定

2.1.8α-MHC-Cre转基因小鼠多种组织的总RNA的提取

2.1.9 Northern杂交

2.2结果

2.2.1心脏特异性表达Cre重组酶转基因载体(α-MHC-Cre-hGH)载体的构建

2.2.2 α-MHC-Cre转基因首建者小鼠的建立

2.2.3 Cre重组酶在转基因小鼠心脏特异性表达

2.3讨论

3.1材料与方法

3.1.1实验动物

3.1.2基因型鉴定

3.1.3 LacZ染色检测Cre重组酶的功能

3.1.4石蜡包埋、切片及复染

3.1.5 PCR及Southern杂交检测Cre重组酶的功能

3.1.6 Southern杂交

3.2结果

3.2.1α-MHC-Cre和ROSA26双转基因小鼠的获得

3.2.2 LacZ染色验证Cre重组酶在心脏中介导基因重组

3.2.3 Cre重组酶的组织分布和功能的进一步验证

3.3讨论

第四章心脏组织特异性SMAD4基因剔除小鼠的表型分析

4.1材料和方法

4.1.1心肌细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的获得和基因型鉴定

4.1.2石蜡包埋和HE染色

4.1.3 PAS染色

4.1.4 Masson染色

4.1.5免疫组织化学

4.1.6小鼠心脏组织的透射电子显微镜观察

4.1.7成年小鼠心肌细胞的分离和测量

4.1.8小鼠心脏超声的检测

4.1.9小鼠颈动脉插管检测血流动力学

4.1.10组织蛋白质的提取

4.1.11 BCA蛋白浓度测定

4.1.12 Western杂交

4.2结果

4.2.1基因剔除小鼠心肌组织中Smad4表达水平降低

4.2.2 Smad4基因剔除小鼠心脏发育无明显异常

4.2.3 Smad4基因剔除小鼠出现心肌肥厚

4.2.4心肌细胞特异性剔除Smad4基因导致心肌细胞尺寸增大

4.2.5 Smad4基因剔除小鼠晚期出现纤维化改变

4.2.6 Smad4基因剔除小鼠超微结构的改变

4.2.7 Smad4基因剔除小鼠心脏收缩功能受损

4.2.8心肌细胞剔除Smad4基因后MEK1-ERK1/2信号通路功能增强

4.3讨论

4.3.1心肌细胞中剔除Smad4基因未影响心脏的发育过程

4.3.2 Smad4基因介导的TGF-β信号与心肌纤维化

4.3.3 Smad4基因剔除引发心脏猝死的机制

4.3.4 Smad4基因剔除后引起心肌肥厚的可能机制

结论

参考文献

研究论文英文稿

在读期间发表论著及会议论文

致谢