纳豆激酶及其衍生物的基因克隆、表达与pro肽的功能研究

摘要

该文以Bacillus natto基因组DNA为模板,通过PCR扩增NK的全长基因,并实现了其在蛋白酶缺陷型枯草杆菌中的高效表达.经超滤浓缩、凝胶过滤层析、离子交换层析,纯化获得纯度为95﹪、比活性11.2×10<'4>IU/mg的rNK,产率为125mg/L.血小板聚集依赖于其特有的功能性受体GPⅡb/Ⅲa的存在.国内外根据RGD三肽序列已设计了许多GPⅡb/Ⅲa受体阻断剂,用于抑制血小板的聚集.因此,在获得重组NK的基础上,我们运用计算机辅助分子模拟的方法建立了NK的空间结构模型,结合功能信息合理设计新型NK分子,采用基因工程和蛋白质工程方法在NK分子表面非功能的loop区引入RGD肽,经表达纯化后用于生物学性质研究.结果显示该衍生物在保持野生型NK相同纤溶活性的同时,尚能显著抑制血小板聚集,具有溶栓与防栓双重功能.结果显示,pro肽在体内体外,通过分子内或分子间的方式均能帮助NK分子的折叠与再折叠,作为一种分子内的分子伴侣（intramolecular chaporeone）,pro肽为NK分子正确折叠所必需.

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一部分重组纳豆激酶及其衍生物的基因克隆与表达

引言

一、纳豆激酶全长基因的克隆及在枯草杆菌中的表达

引言

材料和方法

结果

讨论

二、兼具溶栓及抗血小板聚集功能的新型重组纳豆激酶衍生物的研制

引言

材料和方法

结果

讨论

总结与展望

第二部分pro肽介导纳豆激酶蛋白折叠的复性研究

引言

一、纳豆激酶成熟蛋白在大肠杆菌中的表达及体外复性研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

二、纳豆激酶原在大肠杆菌中的表达及体外复性研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

三、纳豆激酶原突变体在大肠杆菌中的表达及复性研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

四、pro肽在大肠杆菌中的表达与功能研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

五、纳豆激酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达

引言

(一)、硫氧还蛋白-纳豆激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

(二)、GST-纳豆激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

讨论

小结

总结与展望

参考文献

综述

后记

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