乙型肝炎病毒聚合酶在重组腺病毒系统中的表达

摘要

乙型肝炎是一个世界范围的传染病,在中国为害尤其严重.乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为引起人类急性、慢性肝炎的主要病原体之一,属嗜肝DNA病毒科.虽然其基因组仅有3.2kb,但其复制和致病机理过程复杂,突变众多,目前还没有根治的方法.因此,发展抗乙肝药物的研究显得尤为必要.乙肝病毒聚合酶(HBV polymerase)是病毒复制的关键酶,具有TP(蛋白引物)、间隔区(删除大部分后不影响功能)、RT(逆转录酶)、RNaseH等多个功能区域,是抗乙肝药物作用的理想位点.乙肝聚合酶很难在感染细胞中分离纯化,也一直很难在哺乳动物细胞中大量重组表达,严重阻碍了抗乙肝药物和乙肝疫苗的研究.该研究选取高复制型的临床分离株HBV-56,克隆拼接了全长的多聚酶基因,并将其插入穿梭质粒,通过重组穿梭质粒在细菌细胞内与带有腺病毒基因组的质粒发生同源重组,得到带有HBV多聚酶的重组腺病毒质粒.该质粒线性化后转染人胚肾细胞转化细胞系293,成功地得到了重组腺病毒.用该重组病毒感染293细胞系,SDS-PAGE检测,发现了新的蛋白的合成,该蛋白质的分子量与文献报道的乙肝聚合酶的分子量一致.用PCR的方法,初步证明了所表达的乙肝聚合酶具有逆转录酶的活性,合成了对应于HBV聚合酶基因的DNA分子.这一结果将促进对于抗乙肝药物研究和对乙肝病毒复制机制的认识.

目录

第一部分综述

一、HBV和乙型肝炎

1.病毒性乙型肝炎研究历史

2.乙肝病毒结构

3.HBV基因组

4.HBV的病理学

二、乙肝病毒多聚酶在病毒复制中的作用及其研究进展

三、HBV多聚酶的重组表达

第二部分实验

一、引言

二、材料和方法

(一)主要仪器设备

(二)实验材料

(三)试剂与溶液

(四)实验方法

三、结果及其分析

1.HBV polymerase基因的克隆

2.重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-pol的获得

3.重组腺病毒质粒pAdEasy-pol的获得

4.重组腺病毒vAd-HBVpol-GFP的获得

5.蛋白表达及其活性分析

四、讨论

参考文献

致谢

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