东乡野生稻耐冷基因和水稻ClpD基因的克隆与表达研究

摘要

该试验选用中国特有的具有强耐冷特性的东乡野生稻作为研究材料,利用抑制差减杂交(Suppression subractive hybridization,SSH)的方法构建了东乡野生稻的低温诱导表达基因的SSH文库,测序后发现部分EST序列可能与耐冷有关.该试验首次从水稻中克隆了编码完整胆碱激酶、富含甘氨酸脯氨酸的蛋白和类脯氨酸伸展蛋白受体激酶三个蛋白的基因序列,序列特征和基因表达分析表明它们可能与耐冷有关.该试验还克隆分析了东乡野生稻的苹果酸酶、磷酸甘油酸激酶和一个功能未知基因3'端核苷酸序列的推测的蛋白序列,发现籼稻、粳稻和东乡野生稻之间相应的基因序列比较保守,差异区主要集中在非编码区.但是在编码区东乡野生稻与籼稻和粳稻之间也存在相当多的变异,其中绝大多数的变异是东乡野生稻和粳稻相同,而与籼稻不同,说明东乡野生稻是偏粳的.三者之间在基因水平上的变异模式支持籼稻和粳稻的平行进化学说.该试验首次从水稻中克隆和鉴定了一个新的OsClpD基因,它属于保守的ClpD亚家族,是组织特异表达的.基因片段全长3140bp,包含一个2884bp的开放阅读框,编码938个氨基酸.进化树分析和同源性搜索表明编码的OsClpD蛋白属于Hsp100/Clp蛋白ClpD亚家族,具有ClpD亚家族的所有典型保守结构特征.基因表达分析证明它可以被低温、干旱和热激胁迫诱导.

目录

摘要

Abstract

综述

一.植物耐冷基因的研究进展

二.HSP100/CLP基因家族研究进展

2.1CLPB亚家族

2.2ClpC亚家族

2.3ClpD亚家族

1.材料

2.方法

2.1.水稻幼苗的培养液配方

2.2.总RNA的提取和mRNA的分离纯化

2.3.基因的克隆和测序

2.4.序列分析

2.5.SSH文库的构建

2.6.感受态细胞的制备和连接物的转化

2.7.3’RACE克隆基因的3’端序列

3.试验结果

3.1抑制差减杂交文库的构建

3.2东乡野生稻与栽培稻基因的核苷酸和蛋白序列的比较

3.3.水稻低温诱导基因的克隆

4.讨论

第二章1水稻叶绿体专一性蛋白酶调节亚基ClpD基因的克隆及其逆境下的差导异表达

1.材料

2.方法

2.1.总RNA的分离和Dnase消化

2.2.OsClpD基因的克隆和测序

2.3.序列分析

2.4.水稻OsClpD基因表达的定量PCR

3.2.OsClpD推测蛋白的特点分析

3.3.OsClpD蛋白前导肽的起源分析

3.4.OsClpD基因在成体植株中各种组织中的差异表达

3.5.OsClpD基因在胁迫下的表达

4.讨论

参考文献

致谢

Publication and manuscripts in preparation

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