骨髓源性心肌干细胞的筛选及其体外向心肌细胞的诱导分化

摘要

目的:建立骨髓间充质干细胞(MMSC)的单细胞克隆,筛选具有特异性心肌分化潜能的骨髓源性心肌干细胞(MCSC),在体外采用5-Aza诱导MCSC向心肌定向分化,探讨5-Aza诱导MCSC向心肌分化过程中心肌特异性结构蛋白的表达变化和超微结构.方法：取成年雄性SD大鼠的骨髓细胞,进行原代培养和单细胞克隆培养.通过c-kit免疫细胞化学标记和RT-PCR检测,筛选出具有特异性心肌分化潜能的MCSC.然后,用5-Aza诱导MCSC向心肌定向分化.在相差显微镜下观察分化后细胞的形态变化和c-kit表达,用RT-PCR检测诱导前后心肌特异性基因表达的变化.取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对cTnT的光密度值作图像分析.透射电镜下观察分化细胞的超微结构.取不同发育期和成熟期SD大鼠的心肌组织作对比研究.结果：骨髓中含有多种MMSC克隆,以不同形态和大小的成纤维细胞样克隆数目最多.成纤维细胞样和扁平多角形细胞克隆呈c-kit免疫染色强阳性,且表达早期心肌形成转录因子Nkx2.5.经体外扩增后获得MCSC.用5-Aza诱导后,MCSC的形态和排列方式发生变化.诱导后1周,细胞呈长梭形平行排列,c-kit表达转为阴性;第2周,细胞变为短柱状,细胞内开始表达cTnT;第3周,相邻细胞间出现细胞连接,细胞内检测到MLC-2v mRNA表达,cTnT表达增强,可见横纹样结构;第4周,多个细胞相互连接形成肌管样结构,并可观察到肌管的自发性搏动,MLC-2v mRNA表达增强,cTnT表达明显,横纹增多,但排列不规则.电镜下可见诱导后4周的细胞内出现心房粒,含有丰富的粗面内质网、糖原和散在的肌丝.在胚胎第11天鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则.新生鼠心肌内横纹增多,排列较规则.1月龄和3月龄大鼠心肌的横纹样结构发达,排列规则.结论：骨髓中含有多种干细胞克隆.该实验从MMSC克隆中筛选了具有心肌特异性分化潜能的MCSC,这将为临床干细胞移植治疗心肌梗死提供理想的干细胞来源.在5-Aa诱导下MCSC可分化为心肌细胞.诱导分化后4周,细胞的cTnT表达特征与胚胎第11天的心肌相类似.表现为未成熟心肌的结构和功能特征.

目录

英文缩写

ABSTRACT

引言

第一部分MMSC的克隆培养和MCSC的筛选

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2 MMSC的分离和原代培养

2.3 MMSC的克隆培养

2.4 MMSC克隆的免疫细胞化学标记

2.5 MMSC克隆的扩增和RT-PCR检测

2.6 MCSC的筛选

3结果

3.1原代MMSC的形态

3.2 MMSC的单细胞克隆

3.3 MMSC克隆的c-kit表达

3.4不同MMSC克隆早期心肌转录因子Nkx2.5的表达

4讨论

第二部分体外诱导MCSC向心肌的定向分化

实验一5-氮杂胞苷诱导MCSC向心肌定向分化

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

实验二诱导MCSC向心肌分化后细胞内cTnT的表达变化

1前言

2材料和方法

3结果

4讨论

参考文献

综述心肌干细胞的定向分化和调控

致谢

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