蓖麻毒素和相思子毒素的提取纯化及基于生物质谱技术鉴定方法的建立

摘要

蓖麻毒素和相思子毒素均属一种植物蛋白毒素，由A、B两条多肽链通过二硫键连接构成，A链是活性链，具有糖苷酶活性；B链为结合链，含有两个半乳糖结合位点。蓖麻毒素和相思子毒素均属于Ⅱ型核糖抑制类蛋白家族(RIPⅡ)，能够抑制细胞蛋白合成而具有极强的细胞毒性。针对这一性质，临床上多利用A链与导向分子如抗体相连构建免疫毒素，将单克隆抗体的特异结合性与毒素A链的强烈杀伤作用结合，发展导向药物，具有十分广泛的临床应用前景。 另外，由于蓖麻类毒素具有极强的毒性，且种植广泛，提取制备方法公开，极易被恐怖组织利用，作为生物战剂进行恐怖袭击。蓖麻毒素和相思子毒素均已被美国疾病控制中心(CDC)列入潜在生物战剂清单之中。在目前没有特效药和解毒药的形势下，发展新的快速、有效的侦检、鉴定蓖麻类毒素的方法，具有十分现实的研究意义。 本课题即是针对这两种毒素，对传统提取纯化方法进行优化、改进，建立了实验室制备技术；并基于生物质谱技术，建立对蓖麻类毒素的检测鉴定方法。本课题的第一部分，主要建立了蓖麻毒素的提取和纯化路线。根据蓖麻毒素对半乳糖的特异性结合能力，采用亲和层析技术将蓖麻种子中大部分杂质除去；由于在植物种子中蛋白毒素总是与凝集素并存，继而我们又根据二者分子量的差异进行了凝胶过滤层析，去除凝集素，纯化得到电泳纯的蓖麻毒素，并对蓖麻毒素的纯度和活性进行了考察。 在论文的第二部分，开展了对蓖麻毒素生物质谱鉴定方法学的建立。主要确定了两条技术路线：其一是基于MALDI-TOF/MS技术，对蓖麻毒素进行SDS-PAGE分离后，经过还原、烷基化、胶内酶切、肽段提取等一系列处理过程，MALDI-TOF/MS测定提取肽段，获得肽质量信息，通过网上数据库检索，进行PMF鉴定；其二是基于ESI/MS技术，将纯化的蓖麻毒素直接在溶液内还原、烷基化、酶切处理，肽混合物进入HPLC分离，获得蓖麻毒素胰酶解HPLC肽谱，ESI-MS在线鉴定，获得各肽片段的HPLC保留时间及质量信息，实现了对蓖麻毒素的鉴定。 相思子毒素类似于蓖麻毒素，因此第三部分的工作主要是借鉴蓖麻毒素的提取鉴定方法，完成对相思子毒素的方法建立。对于相思子毒素的纯化过程，我们对纯化方法进行优化，一步除去凝集素，并通过离子交换层析得到两种不同亚型的相思子毒素(Abrin-a，Abrin-b)；对提取的毒素进行了纯度和活性的考察；基于MALDI-TOF/MS技术，对两种不同亚型的相思子毒素进行了PMF的鉴定。 总之，通过本课题的研究，确定了蓖麻类毒素提取、纯化的实验室制备技术，并建立了生物质谱方法对蓖麻毒素和相思子毒素的鉴定方法，为这两种毒素今后的临床研究和医学防护奠定了基础。

目录

缩略词对照表

前言

第一部分蓖麻毒素的提取与纯化

一引言

二实验部分

1.实验材料与仪器

2.实验方法

三实验结果

1.粗提液亲和纯化结果

2.凝胶过滤纯化结果

3.SDS-PAGE纯度分析结果

4.质谱测定分子量

5.蓖麻毒素毒性考察结果

四讨论

1.蓖麻毒素纯化条件的优化

2.亲和柱的维护

3.生物质谱测定分子量

五小结

第二部分生物质谱技术鉴定蓖麻毒素

一设计思想

二实验材料与方法

1.实验材料与仪器

2.实验方法

三实验结果

1.肽质量指纹谱(PMF)鉴定结果

2.蓖麻毒素胰酶切肽谱的HPLC分离条件确定

3.蓖麻毒素肽谱(peptide mass mapping)的HPLC-ESI/MS鉴定结果

四讨论

1.MALDI-TOF/MS和HPLC-ESI/MS鉴定结果的对比

2.酶切过程对结果的影响

3.尿素、SDS等助溶剂对酶解效果的影响

4.ESI/MS对多肽分子量的测定及分析

五小结

第三部分相思子毒素的提取纯化及生物质谱鉴定

一引言

二实验部分

1.实验材料与仪器

2.实验方法

三实验结果

1.亲和纯化结果

2.离子交换层析

3.纯度考察

4.相思子毒素毒性考察结果

5.相思子毒素的鉴定

四讨论

1.相思子毒素提取纯化过程的优化

2.溶剂对ESI/MS测定蛋白质分子量的影响

3.相思子毒素两种亚型性质对比

五小结

结语

参考文献

附录

生物毒素的分析

研究生期间撰写与发表文章

致谢