蓖麻毒素和相思子毒素标准物质制备及其定值分析与快速检测技术

摘要

蓖麻毒素（ricin toxin，RT）和相思子毒素(abrin toxin，AT)是两个结构和功能类似的植物毒素，具有毒性强、来源广、易制备等特点，是生物武器核查清单中唯一的两种植物蛋白毒素，也是重要的生物恐怖剂之一。面对防生物战和反生物恐怖的迫切需求，蓖麻、相思子毒素的快速检测和防治已成为一个研究热点，为此，本论文开展了两种毒素蛋白标准物质及其定值与快速检测方法的研究。
　　第一，针对毒素蛋白的标准物质，建立一种高效亲和介质与凝胶过滤柱相结合的蓖麻和相思子毒素简便的纯化与制备方法，并对纯化后毒素进行特征鉴定与标准物质定值分析。
　　首先，选取了云南、新疆等不同产地的蓖麻和相思子种子，种子去壳后匀浆抽提，经硫酸铵沉淀提取粗毒液，随后利用可高效特异结合毒素与凝集素的半乳糖残基亲和介质直接纯化粗毒液，去除粗毒液中的所有杂蛋白，再将去除杂蛋白的粗毒液上样到凝胶过滤柱，利用分子量的差异将毒素与凝集素分离，收集蓖麻毒素或相思子毒素部分，最后获得了各产地天然蓖麻、相思子毒素纯化物，经12％ SDS-PAGE分析RT与AT的纯度均在95％以上，RT、AT的分子量大小分别约为64 kDa、65 kDa。
　　其次，对纯化后的天然毒素进行特征分析。N-端测序结果显示各产地毒素序列一致，而蛋白热稳定试验结果表明各产地毒素结构无差异，但在质谱鉴定结果中，新疆产地的RT和云南产地的AT分值最高，因此作为标准物质候选物。RT和AT标准物质经HPLC鉴定，其纯度均达95％以上，经SMMC-7721细胞毒性试验测定，蓖麻毒素细胞CT50为2.35±0.26 ng/ml，而相思子毒素CT50达到0.0032±0.0012 ng/ml;小鼠毒性试验结果显示蓖麻毒素小鼠LD50大约为15μg/kg，相思子小鼠LD50约为5.3μg/kg。
　　此外，将鉴定后的毒素溶液1 mL/瓶分装冻干，RT分装180瓶，AT分装120瓶。然后对RT、AT标准物质进行定值分析，包括测定蛋白的绝对含量、均一性和稳定性。利用高效液相色谱(HPLC)与电感耦合等离子体串联质谱(ICP-MS)方法，通过对两种毒素蛋白质中的硫元素测定，实现了蛋白质的绝对定量并可将蛋白质的含量结果溯源到国际SI单位。经HPLC/ICP-MS测定，蓖麻毒素含量为25.01μg/瓶，不确定度为2.77μg/瓶，且均一性良好，抽检11瓶样品相对标准偏差(RSD)仅为4.06％;相思子毒素定量为46.79μg/瓶，不确定度为4.66μg/瓶，均一性良好，RSD为4.81％;且两种毒素稳定性良好，-80℃存放6个月均可以保持良好的活性。
　　第二，针对两种毒素的检测，利用单克隆与多克隆抗体，结合金标记技术研制了蓖麻、相思子毒素的单重与双重快速免疫层析检测卡，并结合表面增强拉曼光谱技术建立了相思子毒素的毛细自驱动微流控芯片检测方法。
　　首先，经兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体的组合优化，以抗RT兔多克隆抗体为捕获抗体，抗蓖麻毒素A链(RTA)单抗为检测抗体，研制出金标记的快速免疫层析检测卡，纯RT样本的检测灵敏度为16 ng/mL，特异性好，与结构相近的AT以及BSA、SEB等无关毒素蛋白均无交叉反应，在检测牛奶、果汁、饼干等模拟样本时，其灵敏度仍保持不变，RT检测卡的长期稳定性试验结果表明，室温条件下有效期达12个月;同样，利用抗AT兔多克隆抗体与抗相思子毒素A链(ATA)单克隆抗体组合，结合金标记技术，研制出AT的胶体金免疫层析检测卡，其纯毒素样本检测灵敏度可达3 ng/mL，特异性良好，与结构相近的RT以及BSA、SEB等无关毒素蛋白也均无交叉反应，检测食品模拟样本时获得了同样的灵敏度，室温条件下可稳定存放12个月。
　　其次，在RT、AT单重检测卡的基础上，以抗RT类毒素兔多抗和单抗为捕获抗体，抗AT单抗和抗RT类毒素兔多抗为检测抗体，首次研制了可同时检测蓖麻与相思子毒素的胶体金免疫层析双重检测卡。经测试发现，当双重检测卡检测PBS中的蓖麻毒素、相思子毒素及2种毒素混合样本时，灵敏度均可达25 ng/mL，而检测食品模拟样本时，灵敏度为50 ng/mL，与单重检测卡相比，具有同样良好的特异性。RT、AT双重检测卡成本更加低廉，还可减少现场检测携带装备数量，为战时使用提供了便利。
　　此外，利用微机械与微电子技术(MEMS)设计加工的硅基片部分上的开放式微柱阵列结构，开发了一种毛细自驱动微流控芯片，具有与硝酸纤维素膜相似的液体毛细驱动作用。然后，采用双抗体夹心法的原理结合表面增强拉曼光谱技术(SERS)，将抗AT类毒素兔多抗分别包被于硅基片与外源性拉曼分子上，建立了基于SERS的微流控芯片快速检测技术，检测相思子毒素的灵敏度达到0.1ng/mL，是传统相思子胶体金免疫层析试纸条的30倍。
　　通过上述研究，我们建立了RT、AT战剂毒素标准物质的制备方法，完成了RT、AT标准物质的定值分析，研制了蓖麻、相思子毒素胶体金免疫层析单重、双重检测卡，前者检测灵敏度介于3～16 ng/mL，后者检测灵敏度介于25～50 ng/mL，利用表面增强拉曼光谱技术，还首次建立了相思子毒素的毛细自驱动微流控芯片检测方法，检测灵敏度高达0.1ng/mL，是胶体金免疫层析检测卡的30倍，这种基于SERS的毛细自驱动微流控芯片技术，有望发展为新型战剂毒素侦检仪。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一章 蓖麻毒素和相思子毒素标准物质的制备与定值分析

引言

实验一 蓖麻毒素标准物质的研制

1 实验材料

2．实验方法

3．实验结果

实验二：相思子毒素标准物质的研制

1 实验材料与方法

2 实验结果

实验三：毒素标准物质的定值分析

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

第二章 蓖麻和相思子毒素快速检测方法研究

引言

实验一：蓖麻毒素快速检测试纸条的研制

1 实验材料

2 实验方法

3．实验结果

实验二：相思子毒素快速检测试纸条研制

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

实验三：蓖麻、相思子毒素双重快速检测试纸条研制

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

实验四：相思子毒素表面增强拉曼光谱检测

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 蓖麻和相思子毒素的检测分析

个人简历

致谢