SiRNA介导Survivin下调抑制膀胱癌细胞生长和侵袭能力的研究

摘要

第一部分凋亡抑制基因Survivin在膀胱癌细胞系中的表达 目的：测定凋亡抑制基因Survivin在3种膀胱癌细胞系中的表达，选择其中Survivin表达较高的细胞系进入后续部分的实验。 方法：引入三种膀胱肿瘤细胞系：T24，SCaBER和5637，分别进行体外培养。通过半定量RT-PCR方法测定这3种细胞系SurvivinmRNA的表达水平；使用Western-blot方法测定Survivin蛋白的表达水平。实验结果和国外的测定结果相比较，确定其表达相对量。 结果：①半定量RT-PCR测定结果：以各种细胞系中Survivin/β-actin做比较，T24、SCaBER和5637三种细胞系的比值分别为0.7474-0.274、0.5994-0.129、0.6994-0.184，结果在统计学上差异无显著性(P>0.05)。这表明，三种细胞系的SurvivinmRNA都有较高的表达，各种细胞系之间表达量差别不大。②Western-blot测定结果：以各种细胞系中Survivin/β-actin做比较，T24、SCaBER和5637三种细胞系的比值分别为0.7994-0.121、0.4294-0.053、0.7694-0.051。统计学分析结果：T24组和5637组差异无显著性(P>0.05)；SCaBER组和5637组差异有显著性(P<0.05)。可见T24细胞和5637细胞的Survivin蛋白表达量差别不大，SCaBER细胞的Survivin蛋白表达量要明显低于T24和5637细胞，SCaBER为5637表达量的55.8％。 结论：根据国外对5637细胞系的Survivin测定结果，可以认为：①T24、SCaBER和5637细胞系均有SurvivinmRNA的高表达；②T24和5637细胞系均有Survivin蛋白的高表达，SCaBER表达量稍低：③Survivin的表达可以提示膀胱癌细胞系T24，SCaBER的肿瘤生物学特性，并为第二部分实验打下基础。 第二部分SiRNA对膀胱癌细胞系SUlWMn表达的抑制作用及其质粒载体的构建 目的：筛选有效抑制膀胱痛细胞系T24，SCaBER中Survivin表达的siRNA序列，并构建其质粒载体。 方法：设计并合成4对针对靶基因序列(Survivin)的siRNA，同时设计合成阴性对照和荧光标记siRNA，分别转染T24和SCaBER膀胱癌细胞系。转染后，半定量RT-PCR方法测定干扰后48小时T24、SCaBER膀胱癌细胞系SurwivinmRNA的表达，Western-blot方法测定干扰后72小时T24、SCaBER膀胱癌细胞系Survivin蛋白表达量，从而确定Survivin被抑制的效果，筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。在找到有效抑制靶基因的siRNA以后，构建相应的质粒载体，转染相应的肿瘤细胞，观察转染效率和对细胞的毒性。 结果：①siRNA转染T24细胞和SCaBER细胞后都有较高的转染效率；②半定量RT-PCR结果：1号siRNA干扰T24细胞48小时后SurvivinmRNA基因表达最低，干扰最有效，抑制率超过60％，统计学分析差异有显著性(P<0.05)：3号siRNA干扰SCaBER细胞48小时后SurvivinmRNA基因表达最低，干扰最有效，统计学分析差异有显著性(P<0.05)，但抑制率不到40％；③Western-blot结果：1号siRNA干扰T24细胞72小时后Survivin蛋白表达最低，干扰最有效，统计学分析差异有显著性(P<0.05)，抑制率60％左右；各siRNA干扰SCaBER细胞72小时后Survivin蛋白表达无明显下降，差异无显著性(P>0.05)，干扰无效。④Westem-blot测定T24细胞转染1号siRNA后连续7天Survivin蛋白表达的变化，干扰后48～96小时Survivin蛋白的相对表达量最低，差异有显著性(P<0.05)，抑制率达到80％左右。⑤以1号siRNA序列构建质粒载体pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi及其阴性对照pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/NONRNAi，转染T24细胞成功，转染效率较高，质粒本身对细胞无毒无害。 结论：①1号Survivin-siRNA对T24细胞Survivin表达有明显抑制作用；②所设计、合成的siRNA中，未发现有任何一条能有效抑制SCaBER细胞Survivin之表达。③根据上述实验结果构建的质粒pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi以及pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAiNON可用于T24细胞转染，转染效率较高，质粒本身对细胞无毒无害。 第三部分靶向抑制T24膀胱癌细胞系Survivin表达对其生长和侵袭能力的影响 目的：了解Survivin-siRNA对T24膀胱癌细胞系生长、凋亡、细胞周期和侵袭能力的影响，并探讨其相关机制。 方法：将T24分为干扰组、对照组、空白组和荧光组：干扰组加入已经筛选出的有效抑制Survivin的siRNA进行干预；对照组加入阴性对照siRNA；空白组不予任何处理；荧光组加入FITC标记的阴性对照siRNA。观察转染效率。 ①采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测T24细胞活力；②Hoechst33258凋亡染色和流式细胞仪检测细胞凋亡，观察细胞周期分布变化；③细胞划痕实验Transwell侵袭实验观察细胞运动和侵袭能力变化。 结果：①MTT的结果显示，T24细胞在转染后72小时后即出现生长能力的下降，至第6天，细胞活力下降40～50％，差异有显著性(P<0.05)，证明等对靶基因的siRNA能有效地抑制T24细胞的活力；②Hoechst33258染色的结身可以明显的观察到干扰组细胞发生凋亡的比率要明显高于对照组和空白组，差异有显著性(P<0.05)，但凋亡比率<30％。流式细胞仪也同样检测到干扰组T24细胞G1峰前典型的凋亡亚二倍体峰，证明存在明确的凋亡。但是流式细胞检测的结果只显示了G2期细胞稍下降，却并没能提示明显的G2/M期阻滞现象。③划痕实验结果表明，划痕后24h、48h、72h，干扰组划痕间距明显大于对照组和空白组，所有差异都有显著性(P<0.05)，表明干扰后T24细胞的运动能力明显下降：Transwell侵袭实验结果干扰后72h，干扰组穿膜细胞数明显低于对照组并空白组，差异有显著性(P<0.05)，表明干扰后T24细胞侵袭能力明显下降。 结论：①Survivin-siRNA可以明显抑制T24膀胱癌细胞的活力；②Survivin-siRNA可以诱导T24膀胱癌细胞凋亡，细胞周期的分布也发生了一定的变化；③Survivin-siRNA可以明显抑制T24膀胱癌细胞的运动和侵袭能力。

目录

摘要

引言

第一部分 凋亡抑制基因Survivin在膀胱癌细胞系中的表达

第二部分 SiRNA对膀胱癌细胞系Survivin表达的抑制作用及其质粒载体的构建

第三部分 靶向抑制T24膀胱癌细胞系Survivin表达对其生长和侵袭能力的影响

全文小结

全文参考文献

致谢

附录Ⅰ 研究生在读期间的论文、综述目录

附录Ⅱ 研究生在读期间的获奖情况

附录Ⅲ 综述：Survivin与膀胱癌