CD73对人乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制的研究

摘要

肿瘤扩散(或肿瘤转移)是指恶性肿瘤细胞由原发部位向周围组织的侵袭和向不连续的远隔部位或器官的转移。肿瘤扩散是癌症患者死亡的最主要原因，也是肿瘤恶性的重要标志和最本质的表现。研究发现，肿瘤扩散是一系列具有内在联系的多个步骤相互作用、多个因素共同参与的结果。而肿瘤细胞的黏附、侵袭及运动等恶性生物学行为在肿瘤扩散中发挥极其重要的作用。 CD73又称为胞外．5’．核苷酸酶(Ecto-5’-Nucleotidase，EC3．13．5，ecto-5'-NT)，通过糖基．磷脂酰肌醇锚定于细胞膜外表面，其功能可以分为两部分：一是水解酶活性，参与嘌呤核苷酸的补救合成途径，水解AMP生成腺苷；另一个是非酶活性，参与细胞跨膜信号转导及细胞黏附等生理功能。 近几年的研究发现，CD73与肿瘤转移有关。临床研究结果显示，乳腺癌组织中CD73的表达和活性明显增高，尤其是已发生淋巴结转移的癌组织中CD73的升高更为显著。雌激素受体阴性的乳腺癌较易发生转移，而雌激素受体阴性乳腺癌细胞的CD73表达明显高于雌激素受体阳性的乳腺癌细胞，二者呈负相关。本研究以此为线索，检测了不同恶性程度的乳腺癌细胞株中CD73的基因表达和活性，同时也进一步深入研究了CD73对乳腺癌细胞黏附、侵袭和运动能力的影响及其机制。 本文主要使用：脂质体转染、高效液相层析法(highperformanceliquidchromatography，HPLCl、Westernblot、RT-PCR、体外侵袭力实验、体外运动力实验、体外黏附力实验、ELISA等研究方法。 研究结果发现：高度恶性人乳腺癌细胞株BT549、MDA231、MDA-MB-435的CD73基因表达和酶活性明显高于低度恶性肿瘤细胞株T-47D。用脂质体将质粒pcDNA-NT5E转染T-47D细胞以后，转染细胞Trans-T-47D的CD73mRNA表达和CD73活性显著升高，并且其侵袭力、运动力以及对细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的黏附力也明显增强。 转染细胞Trans-T-47D进一步用CD73的特异性抑制剂α，β-亚甲基二磷酸腺苷(alpha，beta-methyleneADP，APCP)孵育，结果显示，APCP可以抑制转染细胞的侵袭力、运动力和黏附力；APCP孵育后再加入腺苷发现，腺苷可以逆转APCP对转染细胞的抑制作用。腺苷也能增强未转染细胞T-47D的侵袭力、运动力及黏附力，这种促进作用呈剂量依赖性。 表皮生长因子受体(epithelialgrowthfactorreceptor,EGFR)与乳腺癌患者的复发、转移及预后密切相关。本研究发现，乳腺癌细胞CD73的表达和EGFR的表达具有相关性；低表达CD73的乳腺癌细胞通过转染过表达CD73后，其EGFR的mRNA和蛋白表达也明显上调。 白介素．8(interleukin-8，IL-8)可以增强癌细胞的侵袭力，促进肿瘤转移。本实验首先观察到，乳腺癌细胞株CD73的表达和其培养液中IL-8的蛋白含量相关；进一步的研究发现，转染细胞Trans-T-47DCD73表达增强后其IL-8的mRNA表达和培养液中IL-8的蛋白含量也显著升高。 文献报道，EGFR信号转导途径能上调IL-8的表达。为了验证在过表达CD73的转染细胞培液中IL-8含量升高是否与表皮生长因子有关，我们在转染细胞培液中加入了表皮生长因子。结果显示，加入表皮生长因子后IL-8含量没有明显变化。说明在过表达CD73的转染细胞中，是CD73表达增强促进了IL-8的合成，而与表皮生长因子无关。 分别用APCP和CD73的单克隆抗体1．E9孵育转染细胞Trans-T-47D，结果显示，APCP和1一E9都不能影响转染细胞培液中IL-8的蛋白含量。表明CD73促进IL-8的合成并非通过腺苷信号转导途径，也不受1．E9结合位点的影响。 基于上述结果我们得出以下结论：1．人乳腺癌细胞CD73的表达和活性与肿瘤的恶性程度有关；2．CD73增强人乳腺癌细胞的侵袭力、运动力和黏附力；3．CD73通过产生腺苷促进人乳腺癌细胞的黏附、侵袭和运动；4．CD73上调人乳腺癌细胞EGFRmRNA和蛋白的表达；5．CD73通过其非酶活性促进人乳腺癌细胞IL-8的基因转录和蛋白合成。

目录

第一部分不同恶性程度的乳腺癌细胞株CD73的表达和活性：引言

第一部分不同恶性程度的乳腺癌细胞株CD73的表达和活性：材料和方法

第一部分不同恶性程度的乳腺癌细胞株CD73的表达和活性：结果

第一部分不同恶性程度的乳腺癌细胞株CD73的表达和活性：讨论

第一部分不同恶性程度的乳腺癌细胞株CD73的表达和活性：参考文献

第二部分CD73表达升高促进人乳腺癌细胞株T-47D的黏附、侵袭和运动：引言

第二部分CD73表达升高促进人乳腺癌细胞株T-47D的黏附、侵袭和运动：材料和方法

第二部分CD73表达升高促进人乳腺癌细胞株T-47D的黏附、侵袭和运动：结果

第二部分CD73表达升高促进人乳腺癌细胞株T-47D的黏附、侵袭和运动：讨论

第二部分CD73表达升高促进人乳腺癌细胞株T-47D的黏附、侵袭和运动：参考文献

第三部分CD73通过腺苷促进乳腺癌细胞株T-47D黏附、侵袭和运动：引言

第三部分CD73通过腺苷促进乳腺癌细胞株T-47D黏附、侵袭和运动：材料和方法

第三部分CD73通过腺苷促进乳腺癌细胞株T-47D黏附、侵袭和运动：结果

第三部分CD73通过腺苷促进乳腺癌细胞株T-47D黏附、侵袭和运动：讨论

第三部分CD73通过腺苷促进乳腺癌细胞株T-47D黏附、侵袭和运动：参考文献

第四部分CD73对乳腺癌细胞株T-47D黏附力、侵袭力和运动力的影响与EGFR、Il-8关系：引言

第四部分CD73对乳腺癌细胞株T-47D黏附力、侵袭力和运动力的影响与EGFR、Il-8关系：材料和方法

第四部分CD73对乳腺癌细胞株T-47D黏附力、侵袭力和运动力的影响与EGFR、Il-8关系：结果

第四部分CD73对乳腺癌细胞株T-47D黏附力、侵袭力和运动力的影响与EGFR、Il-8关系：讨论

第四部分CD73对乳腺癌细胞株T-47D黏附力、侵袭力和运动力的影响与EGFR、Il-8关系：参考文献

结论

致谢

附录：硕士生期间撰写和发表的论文及获奖情况

综述：CD73在肿瘤中的研究进展

论文独创性声明及论文使用授权声明