糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及雌、孕激素对其调节作用

摘要

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，尽管近年来手术和联合化疗已经取得很大进展，但是由于其发病机制至今尚不清楚，束缚了新疗法的开发，再加上棘手的化疗耐药问题，因而卵巢上皮性癌的5年生存率一直未能提高。 许多恶性肿瘤都有一个共有的特征：葡萄糖代谢率的升高。大量葡萄糖的分解代谢不仅可以为肿瘤的快速生长提供能量，而且可以为肿瘤细胞合成DNA、RNA和脂类提供前体物质，因而肿瘤细胞中常存在糖代谢相关酶类的活性异常。其中糖原合酶激酶一3β(GSK-3β)兼有调节葡萄糖代谢和调节其它转录因子、结构蛋白活性等多种功能，故引起研究者们对其与肿瘤发展关系的广泛研究。但是研究结论却不一致，存在着不同的观点。有关GSK-3B与卵巢癌的研究，更是鲜见报道。本课题从细胞增殖的角度入手，用体外和体内实验，从细胞生长曲线、BrdU掺入率、细胞克隆形成能力和裸鼠成瘤实验四个不同的方面来观察GSK-31[3活性改变对卵巢癌细胞的短期和长期影响；并通过检测细胞周期和细胞周期蛋白表达的变化以初步探讨GSK-3B影响卵巢癌细胞增殖的机制；同时观察提高GSK-3β活性对卵巢癌细胞的化疗增敏作用；最后，探讨了在卵巢癌发生发展过程中有重要影响的雌、孕激素对GSK-3β活性的调节作用。我们的实验结果提示GSK-3β可以影响卵巢癌细胞的增殖和化疗敏感性，雌激素和孕激素可调节卵巢癌细胞GSK-3β的活性。 本课题共分三部分：(1)GSK-3β对卵巢癌细胞增殖的影响；(2)GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究；(3)雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用。 第一部分糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖的影响 目的探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)对卵巢癌细胞增殖的影响。 方法以蛋白免疫印迹法检测总GSK-3β和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3pSer9)在卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2中的表达水平；采用细胞计数法描记细胞生长曲线，以检测GSK-3β抑制剂对SKOV3和ES-2细胞生长的影响；将SKOV3细胞分成4组，将增加GSK-3β活性的质粒GSK-3βS9A和其空载对照质粒pCS2以及降低GSK-3β活性的质粒GID5-6和其对照质粒GID5-6LP，分别用电转法与绿色荧光蛋白(GFP)质粒，共同转染入细胞中，采用5一溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入实验检测GSK-3β活性对卵巢癌细胞增殖的影响；利用G418筛选瞬时转染的SKOV3细胞得到稳定转染株后，采用克隆形成实验，观察改变GSK-3β的活性对卵巢癌细胞增殖的长期影响。用GSK-3β抑制剂LiCI或对照NaCl处理SKOV3细胞后，分别注射于裸鼠皮下，每只裸鼠注射5×106个细胞，3周后处死裸鼠，取瘤称重并用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，计算肿瘤体积。 结果SKOV3和ES-2细胞均表达GSK-3β和pGSK-3βSer9，SKOV3细胞中pGSK-3β5er9的表达水平比ES-2低，而两者总GSK-3β的表达水平相似。GSK-3β抑制剂可抑制SKOV3和ES-2细胞的生长。与对照pCS2相比，转染GSK-3βS9A质粒以上调GSK-3β的活性，可增加SKOV3细胞BrdU的掺入率；相反，与其对照GID5-6LP相比，转染GID5-6质粒来下调GSK-3β的活性，可减少SKOV3细胞BrdU掺入率。分别与各自的对照质粒相比，稳定转染GSK-3βS9A可形成较多的细胞克隆，而稳定转染GID5-6则形成的细胞克隆较少。与对照NaCl相比，LiCI可抑制SKOV3细胞在裸鼠体内的生长。 结论GSK-3β具有促进卵巢癌细胞增殖的作用，抑制GSK-3β的活性可减少卵巢癌细胞的增殖。 第二部分GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究 目的探讨GSK-3β调节卵巢癌细胞增殖的机理及其对化疗敏感性的影响。 方法以电转法将提高GSK-3β活性的GSK-3βS9A质粒和降低GSK-3β活性的GID5-6质粒及其相关对照质粒与绿色荧光蛋白(GFP)质粒共同转染入卵巢癌细胞株SKOV3中，用流式细胞仪进行荧光分选，检测转染了上述质粒的细胞所处的细胞周期；用蛋白免疫印迹法检测转染上述质粒对细胞周期蛋白cyclinD1表达的影响；采用碘化丙啶(PI)染色及荧光显微镜下观察死亡细胞法筛选泰素敏感实验的适合浓度(即24hIC10)；以GSK-3βS9A质粒和对照质粒转染SKOV3细胞后，用适当浓度的泰素处理细胞24h，采用PI染色并于荧光显微镜下计数死亡细胞数，检测泰素作用的敏感性。 结果转染GSK-3pS9A质粒，提高GSK-3β活性后，有45．5+1.7％的SKOV3细胞进入S期，而其转染对照质粒后只有37．5+2．9％的细胞进入S期；相反，转染GID5-6质粒降低GSK-3β活性后，只有26．8±2．1％的SKOV3细胞进入S期，而转染对照质粒后进入S期的细胞百分比为36．3±1．5％，差异有统计学意义(P<0.05)。转染GSK-3βS9A质粒可上调细胞周期蛋白cyclinD1的表达，而转染GID5-6质粒可下调cyclinD1的表达。泰素作用24h的ICl0为0．01μmol／L，用该浓度的泰素分别处理转染了GSK-3pS9A质粒及其对照质粒的SKOV3细胞，PI染色显示转染GSK-3βS9A的细胞经泰素处理24h后，有27．2±4．1％死亡，而转染对照质粒的细胞经处理后，只有12．8±0．8％的细胞死亡，差异有统计学意义(P<0．01)。 结论GSK-3β可通过上调cyclinD1的表达水平，促进SKOV3细胞进入S期，从而使卵巢癌细胞增殖。提高GSK-3β活性可增加SKOV3细胞对泰素的敏感性。 第三部分雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用 目的探讨雌激素和孕激素对卵巢癌细胞GSK-3B活性的调节作用。 方法用含有10％活性炭处理的胎牛血清的无酚红RPMI一1640培养基，预处理SKOV3细胞3天。将10-8mol／L、10-7mol／L或10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮孵育SKOV3细胞，以DMSO为对照，48h后用蛋白免疫印迹法检测总GSK-3p和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3pSet9)的表达水平。然后用10-6mol／L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮，处理24h、48h或72h后检测总GSK-3β和pGSK-3βSer9的表达水平。 结果经预处理后，17-β雌二醇可下调SKOV3细胞pGSK-3βSer9的表达水平，并随着剂量的加大和时间的延长，作用愈明显。相反，醋酸甲羟孕酮孵育后SKOV3细胞pGSK-3pSet9的表达水平上升，并随着剂量的加大和时间的延长，作用更加显著。而总GSK-3β的表达水平没有明显变化。 结论雌激素可下调pGSK-3βSet9的表达水平，从而提高GSK-3β的活性，孕激素则可通过上调pGSK-3βSet9的表达水平而降低GSK-3β的活性，并且具有时间和剂量依赖性效应。

目录

前 言

第一部分糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖的影响

第二部分GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究

第三部分 雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用

小 结

参考文献

综述糖原合酶激酶-3β与肿瘤

研究生期间投稿的论文

致 谢

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