糖原合成酶激酶-3β在子宫内膜样腺癌中的表达及孕激素对其调节作用

摘要

目的:
　　 通过子宫内膜样腺癌患者手术组织切片检测及体外细胞实验,探讨子宫内膜样腺癌糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)表达情况,及GSK-3β对子宫内膜样腺癌细胞增殖和侵袭的影响,以及孕激素对子宫内膜样腺癌细胞GSK-3β的调节作用。
　　 材料与方法:
　　 GSK-3β在子宫内膜样腺癌中的表达
　　 采用免疫组化法检测2006年1月-2006年12月在复旦大学附属妇产科医院诊治、经病理证实、病史资料完整的25例子宫内膜样腺癌、9例正常子宫内膜石蜡包埋标本中GSK-3β的表达情况。通过RealTimePCR法检测高、中、低分化子宫内膜样腺癌细胞Ishikava、HEC-1-A和KLE中GSK-3βmRNA表达,并用Westernblot法检测其蛋白表达。
　　 6SK-3β对子宫内膜样腺癌细胞增殖和侵袭的影响
　　 运用GSK-3β小分子干扰RNA(GSK-3βsiRNA)技术干扰子宫内膜样腺癌细胞,通过荧光显微镜观察转染后细胞内绿色荧光蛋白表达情况,并用RealTimePCR法和Westernblot法检测GSK-3βmRNA及其蛋白活性形式(pGSK-3βTyr216)的表达以测定干扰效率。然后采用Brdu掺入实验、流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率、以及Westernblot法检测凋亡相关蛋白caspase-3,研究细胞增殖力的改变;最后用Transwell侵袭试验和明胶酶谱法检测明胶酶-A(MMP-2)的活性,观察细胞侵袭力的变化。
　　 孕激素及AKT信号通路对GSK-3β表达的调控
　　 采用AKT小分子干扰RNA(AKTsiRNA)干扰Ishikava细胞,用RealTimePCR法和Westernblot法检测AKTmRNA及其蛋白表达,以验证干扰效率;并检测GSK-3βmRNA及pGSK-3βTyr216蛋白表达情况,研究AKT对GSK-3β的调控;通过流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率,Westernblot法检测细胞周期相关蛋白pCyclinD1Thr286、凋亡相关蛋白pCaspase-8Thr62表达情况,了解AKT对细胞周期的影响。
　　 将Ishikava细胞预处理3天后加用醋酸甲羟孕酮(MPA),然后用Westernblot法检测不同浓度MPA作用24h、48h、72h后,AKT和pGSK-3βTyr216蛋白的表达情况;用MTT法检测细胞增殖力的变化;并通过明胶酶谱法检测MVP-2、MMP-9的活性,了解细胞侵袭力的改变,从而研究孕激素对AKT和GSK-3β表达和功能的影响。
　　 结果:
　　 GSK-3β在子宫内膜样腺癌中的表达
　　 免疫组化结果显示:相对于正常子宫内膜,GSK-3β在子宫内膜样腺癌中高表达;其中,Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期子宫内膜样腺癌GSK-3β表达高于Ⅰ期;Ⅲ级子宫内膜样腺癌GSK-3β表达高于Ⅰ级、Ⅱ级;有预后不良高危因素的高危组GSK-3β表达高于低危组。RealTimePCR和Westernblot结果均显示中、低分化细胞GSK-3βmRNA及蛋白表达量高于高分化细胞。
　　 GSK-3β对子宫内膜样腺癌细胞增殖和侵袭的影响
　　 子宫内膜样腺癌细胞转染GSK-3βsiRNA后,GSK-3βmRNA及蛋白表达均下调,说明小干扰RNA能够有效抑制GSK-3β表达;Ishikawa、HEC-1-A细胞GSK-3βsiRNA组Brdu掺入率降低,流式细胞仪检测发现S期细胞数比例减少,细胞凋亡率增加,Westernblot结果也显示凋亡相关蛋白caspase-3表达上调,细胞增殖力下降;Transwell侵袭试验中穿过滤膜细胞数减少,明胶酶谱结果显示明胶酶-A(MMP-2)活性减弱,细胞侵袭力下降。但是,转染GSK-3βsiRNA后各实验组间KLE细胞的增殖情况和侵袭能力无明显改变。
　　 孕激素及AKT信号通路对GSK-3β表达的调控
　　 Ishikawa细胞转染AKTsiRNA后,AKTmRNA和蛋白表达均低于对照组,说明小干扰RNA能够有效抑制AKT表达;Westernblot结果显示pGSK-3βTyr216蛋白表达上调;流式细胞仪检测结果发现S期细胞数比例减少、细胞凋亡率增加,Westernblot结果也显示pCyclinD1Thr286和pCaspase-8Thr62蛋白表达上调。
　　 10-8mol/LMPA作用48h后,Westernblot结果显示AKT和pGSK-3βTyr216蛋白表达下调,同时MTT实验中细胞存活率降低,明胶酶谱检测MMP-2、MMP-9活性下降。10-6mol/LMPA作用48h后,Westernblot结果显示AKT蛋白表达下调,但pGSK-3βTyr216蛋白表达不变,MTT结果显示细胞存活率与对照组相比无统计学差异;明胶酶谱检测MMP-2、MMP-9活性增加。
　　 结论:
　　 GSK-3β蛋白在子宫内膜样腺癌中高表达,且与手术病理分期、组织分级相关、与细胞分化程度相关。pGSK-3βTyr216可促进高、中分化的子宫内膜样腺癌细胞的增殖和侵袭,对低分化的内膜样腺癌细胞的增殖和侵袭则无明显影响。在高分化子宫内膜样腺癌细胞Ishikawa中,AKT可抑制GSK-3β活性,低浓度的MPA抑制AKT和GSK-3β表达,抑制细胞增殖和侵袭;而高浓度MPA也能抑制AKT表达,但对GSK-3β表达和细胞增殖无明显影响,反而促进细胞侵袭。