采用载体介导的siRNA抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体表达的实验研究

摘要

第一部分 目的: 探讨质粒介导的短发夹RNA(shRNA，short hairpin RNA)表达载体对人肺腺癌细胞株(human lung adenocarcinoma cell lines．HLAC)中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达的抑制效应。方法①构建靶向EGFR基因的shRNA质粒表达载体(pShEGFR)。②利用lipofectamine2000将pShEGFR载体转入HLAC-A549和SPC-A1中，Real-time PCR检测EGFR mRNA表达变化；免疫荧光、流式细胞仪、Western blot检测EGFR蛋白水平变化。结果 成功构建pShEGFR，并通过测序证实。转染后2 d，pShEGFR对A549和SPC-A1中EGFR mRNA的抑制率分别达72.9％和81.0％；EGFR蛋白抑制率在转染后6 d最高，在A549和SPC.Al中分别达74.1％和84.6％。结论质粒介导的shRNA表达载体可在A549和SPC-A1细胞中下调EGFR mRNA和蛋白水平的表达，为采用载体介导的siRNA用于靶向EGFR的抗肿瘤研究提供了可能。 第二部分: 靶向EGFR的siRNA对肺腺癌细胞株生物学行为的影响 目的: 探讨靶向EGFR基因的shRNA表达载体对HLAC-A549和 SPC-A1细胞增殖、凋亡、迁移及药物敏感性的影响。 方法:①利用lipofectamine2000将pShEGFR转染至HLAC-A549和SPC-A1。②克隆形成实验观察细胞生长变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；Millcell小室检测细胞迁移；MTT法检测细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性。 结果: pShEGFR对A549和SPC-A1细胞的克隆形成抑制率分别为62.8％和68.9％。pShEGFR使A549和SPC-A1细胞G0／G1期比例显著增加，S期比例显著下降，并促进A549和SPC-A1细胞凋亡；pShEGFR显著抑制A549和SPC-A1细胞迁移；pShEGFR可将A549和SPC-A1细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性分别提高6.7和6.0、5.5和4.7、6.6和6.4倍。 结论:靶向EGFR基因的shRNA质粒表达载体能够通过下调EGFR蛋白水平抑制肺腺癌细胞生长、迁移、促进细胞凋亡，并提高细胞对不同化疗药物的．敏感性。 第三部分: 靶向EGFR的siRNA重组腺病毒载体抑制肺腺癌生长的体内实验研究 目的:体内试验验证重组腺病毒载体介导的siRNA是否能有效下调HLAC中EGFR表达及其抗肿瘤效应。 方法:①构建表达针对EGFR的shRNA穿梭载体，将穿梭载体和骨架载体共转染293包装细胞，制备重组腺病毒(Adv-shEGFR)。②Adv-shEGFR体外感染HLAC-A549和SPC-A1，Real-time PCR检测EGFR基因mRNA表达变化；免疫荧光、Western blot检测EGFR基因蛋白水平变化。③体外感染病毒后的HLAC进行动物接种，测量肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，记录肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。④建立荷瘤鼠模型，瘤内注射Adv-shEGFR，测量肿瘤体积绘制生长曲线，记录肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。利用免疫组化和Western blot测定肿瘤组织的EGFR蛋白水平；免疫组化检测肿瘤组织中PCNA水平；TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞。 结果:感染Adv-shEGFR3d后，对A549，SPC-A1细胞中EGFRmRNA水平的抑制率分别达81．2％和79．8％；感染Adv-shEGFR3d和6d后，对A549细胞中EGFR蛋白水平抑制率分别为52．3％和80．2％，对SPC-A1细胞中EGFR蛋白水平抑制率分别为45．5％和85．8％。感染Adv-shEGFR的A549，SPC-A1细胞体内生长能力明显受到抑制。在A549，SPC-A1裸鼠移植瘤模型中，瘤内注射Adv．shEGFR对EGFR蛋白表达的抑制率分别为62．8％和52．4％，并明显抑制肿瘤的生长。 结论:靶向EGFR的shRNA重组腺病毒载体能够通过下调HLAC中EGFR的表达并有效抑制HLAC的体内生长，为开发基于RNA!技术的抗肿瘤药物提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分质粒介导的siRNA抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达

第二部分靶向EGFRsiRNA对肺腺癌细胞株生物学行为的影响

第三部分靶向EGFR的siRNA重组腺病毒载体抑制肺腺癌生长的体内实验研究

参考文献

文献综述肺癌生物治疗研究进展及评价

后记

博士生期间发表的学术论文

博士后期间发表的学术论文、专著