趋化因子受体CCR1在肝细胞肝癌侵袭和转移中作用研究

摘要

肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是全球第六常见的癌症，亦是我国癌症中的第二号杀手，全球40％以上的肝癌发生在我国。由于肝癌早期诊治困难、预后极差，总5年生存率仅为5～6％。尽管手术治疗仍为目前最重要的治疗手段，但即使是根治性切除，5年内仍有60～70％的病人出现复发转移，切除后复发转移是进一步提高疗效的瓶颈。因此探索肝癌转移复发的机制，评估肿瘤的侵袭能力，预测患者预后，寻找有效的干预靶点，在复发高危人群进行防治成为进一步提高肝癌生存率的关键。但是迄今为止对肝癌转移复发分子机理知之甚少，也缺乏特异有效的治疗手段。 近年来研究表明肿瘤的侵袭转移是一个多步骤的复杂动态过程，在这一过程中有多种因素如细胞因子、细胞粘附分子，血管生成因子、细胞外蛋白酶和生长因子等参与了复发转移的过程。越来越多的研究表明肿瘤细胞表面表达的趋化因子受体与趋化因子相互作用在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。起初研究认为趋化因子在介导免疫细胞粘附于内皮细胞、激发其通过血管内皮细胞及组织浸润而招募免疫细胞至炎症部位发挥重要作用。已有的研究表明肿瘤细胞的侵袭及转移与免疫细胞的迁移及浸润有着很多共同点。趋化因子和趋化因子受体的相互作用能引起肿瘤细胞胞膜皱褶和伪足的形成从而诱导肿瘤细胞的趋化性迁移，最终诱导肿瘤细胞从原发部位脱落并通过细胞外基质和血管基底膜，进入血液循环并转移至靶器官。 有研究发现六种人肝癌细胞表面均表达有活性的CC趋化因子受体1(CCchemokine receptor 1，CCR1)。本课题组也发现在本所建立的人肝癌细胞系中表达CCRl，RT-PCR和Western印迹在肝癌组织及相应癌旁肝组织中均可以检测到CCR1 mRNA及蛋白，肝癌组织表达水平高于癌旁肝组织，其表达水平与肝癌侵袭性相关。但是，CCR1在肝癌的侵袭过程中具体作用及分子机制，以及CCR1在判断肝癌侵袭性和预后指标的价值亟需深入研究。 本研究依据microRNA(miRNA)介导的RNA干扰(RNAi)原理，以高转移潜能的人肝癌细胞HCCLM3为研究对象，应用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体研究体外细胞水平下调CCR1基因表达对肝癌细胞增殖和侵袭性的影响，寻找干扰CCR1基因的最佳作用位点，构建慢病毒载体，探讨以CCR1为靶点抑制肝癌侵袭能力的治疗可行性；初步研究CCR1影响肝癌细胞HCCLM3侵袭能力的分子机制；同时应用免疫组织化学法测定CCR1蛋白在288例肝癌组织芯片内的表达，研究CCR1作为判断肝癌侵袭性和患者预后指标的价值。 结论 1．高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达可被miRNA介导的RNAi有效抑制。针对CCR1 mRNA的不同序列的下调CCR1表达的效果不同，其中针对CCR1 mRNA序列设计的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体miR-CCR1-656能够特异性和高效的抑制高转移潜能人肝癌细胞HCCLMB的CCR1表达，成功构建含该序列的针对人CCR1基因miRNA介导的RNAi慢病毒载体。 2．人肝癌细胞HCCLMB中CCR1的表达被有效抑制后其侵袭性降低。本实验结果提示CCR1与人肝癌细胞HCCLMB侵袭密切相关。CCR1参与人肝癌细胞HCCLM3的侵袭可能和HCCLM3分泌的MMP2有关。 3．肝癌组织中肝癌细胞表达的CCR1阳性是影响肝癌术后无瘤生存率和总体生存时间的独立危险因素，说明CCR1与肿瘤侵袭复发和患者预后密切相关，CCR1表达检测有助于对肝癌术后复发的预测。 创新点 1．肝癌细胞HCCLM3中CCR1的表达可被质粒导入的外源性miRNA有效抑制，进而降低人肝癌细胞侵袭性，CCR1可以成为新的治疗靶点。 2．对CCR1调控人肝癌细胞侵袭转移能力的分子机制进行研究，发现CCR1可以调控MMP2的表达参与肝癌细胞侵袭过程。 3．通过高通量和大样本的分析发现肝癌组织中肝癌细胞表达的CCR1与肝癌细胞侵袭和预后密切相关，CCR1表达检测有助于对肝癌术后复发的预测。

目录

声明

引言

第一部分：应用miRNA介导的RNAi抑制人肝癌细胞CCR1表达的序列筛选和慢病毒载体的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：抑制CCR1蛋白表达对肝癌细胞侵袭性的影响及其机制

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分：CCR1作为判断肝癌侵袭性和患者预后的指标价值研究-肝癌组织芯片免疫组织化学表达分析

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述 小肝癌补救移植策略

附件

致谢