石半夏凝集素基因的克隆及甘露糖特异结合凝集素的抗真菌研究

摘要

凝集素是一类含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质。单子叶植物甘露糖结合型凝集素(monocot mannose-binding agglutinins)是其中比较大的一个家族，其中以雪花莲凝集素为代表的一个亚类显示出良好的抗同翅目昆虫活性，以天麻抗真菌蛋白为代表的另一亚类则具有突出的抗真菌活性，它们在植物抗虫和抗病基因工程中均具有很大的应用潜力。 真菌对农作物的危害呈现间歇爆发的特征，并存在一定的普遍性。病菌除导致植物叶片病斑从而影响光合作用外，还可侵染茎秆和果实，影响品质，造成经济损失。为了为植物抗病基因工程提供更多的候选基因，本文对植物凝集素基因进行了研究。以石半夏(Pinellia cordata)为材料，利用RACE-PCR技术，成功地克隆出了石半夏凝集素基因，并对其抗真菌功能进行了研究。此外，本文还对已经克隆的马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、文殊兰(Crinum asiaticum)、石斛(Dendrobium officinale)和姜(Zingiber officinale)凝集素分别进行了抗真菌功能的初步研究，得到如下结果： 1.首次从天南星科植物石半夏中克隆了石半夏凝集素基因pcl。pcl的全长cDNA为1182bp，含有一个768bp的开放阅读框，编码一个由256个氨基酸组成的前体蛋白。对PCL和其他单子叶甘露糖结合凝集素的序列进行了同源性比对，预测了该蛋白的二级和三级结构，结果表明，PCL可能是一个有凝集素功能的蛋白。半定量RT-PCR分析表明，pcl在石半夏植物的各个部位都有转录，其中在珠芽中的转录水平最高。 2.分别构建了含pcl、zaa(马蹄莲凝集素基因)和caa(文殊兰凝集素基因)的原核表达载体，并成功地实现了这三个基因在E. coli中的表达，对表达的重组蛋白进行了纯化，并从植物中提取了天然的PCL，作为对照进行了凝血活性实验。结果表明重组PCL具有和天然蛋白一样的凝血活性。抑菌实验表明，重组ZAA能抑制叶霉病菌(Fulvia fulva)的生长，重组CAA蛋白和重组PCL蛋白抑菌效果不明显。 3.分别构建了含pcl、doa(石斛凝集素基因)和zoa(姜凝集素基因)的植物表达载体，并导入到根癌农杆菌C58C1中，对拟南芥进行了转化。分别获得了含doa基因和zoa基因的转基因拟南芥植株及其后代，研究表明，外源基因在转基因植株后代中的分离比符合孟德尔遗传。初步抑菌实验表明，转姜凝集素基因的拟南芥对叶霉病菌有一定抗性作用。 本研究为利用基因工程技术改良农作物抗病性提供了更多的候选基因。

目录

声明

摘要

引言

第一章文献综述

1.1凝集素的概述

1.2植物凝集素的分类

1.3植物凝集素的结构特性

1.4植物凝集素的主要功能

1.5植物凝集素的应用前景

1.6本研究的目的意义

第二章石半夏凝集素基因的克隆

2.1材料与试剂

2.1.1材料、菌种及载体

2.1.2试剂盒及购买的试剂

2.1.3自配的主要标准试剂

2.2实验方法

2.2.1通过一步法RT-PCR获得目的基因的核心片断

2.2.2通过3'RACE获得目的基因的3'端片断

2.2.3通过5'RACE获得目的基因的5'端片断

2.2.4石半夏凝集素基因全长cDNA的获得

2.2.5 PCL基因的生物信息学分析

2.2.6基因表达特异性分析

2.3结果和讨论

2.3.1 PCL全长cDNA的克隆及其特征分析

2.3.2 PCL和其它的单子叶植物甘露糖结合凝集素的序列比较

2.3.3 PCL的二级结构和三级结构分析

2.3.4 PCL的分子进化分析

2.3.5半定量RT-PCR分析

第三章石半夏、马蹄莲和文殊兰凝集素基因的原核表达、纯化及功能研究

3.1材料与试剂

3.1.1菌株和质粒

3.1.2酶与试剂

3.1.3引物

3.2实验方法

3.2.1原核表达载体的构建

3.2.2目的蛋白的诱导表达及纯化

3.2.3表达产物的功能研究

3.3结果和讨论

3.3.1原核表达载体的构建及分析

3.3.2目的蛋白的诱导表达结果

3.3.3表达产物的特性分析

3.3.4重组蛋白的纯化

3.3.5重组蛋白的功能研究

第四章石半夏、石斛及姜凝集素基因植物表达载体构建和拟南芥转化研究

4.1材料与试剂

4.1.1菌株和质粒

4.1.2引物

4.1.3植物材料及培养基

4.1.4酶与试剂盒

4.1.5其他试剂

4.2实验方法

4.2.1植物表达载体的构建(如图4.1所示)

4.2.2浸花法(floral dip)转化拟南芥

4.2.3转基因拟南芥的分子检测

4.2.4转基因拟南芥子代分析及纯系的获得

4.2.5转基因拟南芥功能分析

4.3结果和讨论

4.3.1表达载体重组pHB质粒的构建及分析

4.3.2转基因拟南芥的筛选

4.3.3 western blot分析

4.3.4转基因拟南芥子代分子检测

4.3.5抑菌实验

参考文献

小结

致谢

附录

博士期间参与的其他研究工作

SCI发表情况：